Практическая работа № 1
КЛОНАЛЬНОЕ МИРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ IN VITRO
Цель занятия. Ознакомиться с методиками стерилизации растительного материала, выделением меристематических верхушек, посадки эксплантов на питательную среду, работы в ламинар-боксе.
Ход работы
Приготовление питательной среды Мурасиге-Скуга
Задание: Приготовить питательную среду для введения в культуру меристематических верхушек, верхушек побегов, боковых почек.
Ход работы: Зная, сколько миллилитров маточного раствора нужно взять из каждого сосуда для приготовления 1 л среды (таблица 1), и умножив эту цифру на запланированный объем среды, отмеряют количество маточного раствора из каждого сосуда и смешивают вместе. Затем добавляют углеводы и после их растворения доводят объем до запланированного. С помощью рН-метра раствор корректируют до нужного рН. Раствор нагревают и небольшими порциями добавляют агар, после начала кипения среду разливают по сосудам.
Таблица № 1. Состав среды Мурасиге-Скуга
|
|
Компоненты | Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг | Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды |
маточный раствор макроэлементов | ||
NH4NO3 | ||
KNO3 | ||
CaCl2 * 2H2O | ||
MgSO4 * 7H2O | ||
KH2PO4 | ||
маточный раствор микроэлементов | ||
KJ | ||
H3BO3 | ||
MnSO4 * H2O | ||
ZnSO4 * 7H2O | ||
Na2MoO4 * 2H2O | ||
CuSO4 * 5H2О | ||
CoCl2 * 6H2O | ||
маточный раствор хелатного железа | ||
FeSO4 * 7H2O | ||
Na2ЭДТА * 2H2O | ||
витамины и органические вещества | ||
Мезоинозит | ||
Никотиновая кислота | ||
Пиридоксин-HCl | ||
Тиамин-HCl | ||
Глицин | ||
Добавлять в виде порошка в среду перед варкой: Сахароза - 30 г/л Агар-агар - 7 г/л рН готовой среды - 5.6-5.8 |
Сосуды с питательной средой закрывают либо фольгой и автоклавируют при 0,9-1 атм. 15-18 мин. в автоклаве. Добавление нетермостойких веществ в питательную среду проводят после ее стерилизации автоклавированием и стерилизации веществ через специальные фильтры в ламинар-боксе.
2. Введение эксплантатов в культуру
Задание: Простерилизовать растительный материал, находящийся в покое, и вегетирующий растительный материал. Приготовить 5-10 меристематических верхушек и посадить на соответствующую среду.
Ход работы: В практике микроклонального размножения используют следующие стерилизаторы: гипохлорид кальция, гипохлорид натрия, перекись водорода, бромная вода, нитрат серебра, сулема (0,1-1% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая,
удаляется плохо), 70% спирт, диацит.
Величина первичного эксплантата зависит от цели клонального микроразмножения. Если необходимо получить небольшое число растений, свободных от вирусной инфекции, то размер эксплантата не должен превышать 150-250 мкм. Эксплантат такого размера представлен меристематическим куполом и 1-2 примордиальными листочками. Установлено, что апикальный купол и близлежащая зона имеют более низкую концентрацию вирусов. Это связано с отсутствием проводящей системы в меристематичсской верхушке. Многие вещества, входящие в питательную среду также ингибируют развитие вирусов. Количество здоровых растений увеличивается, если культуру меристематических верхушек сочетать с предварительной термотерапией маточных растений (38°С, 4-8 недель).
|
|
Если ставится цель быстро размножить исходные здоровые растения, то применяют культуру верхушек побегов. Размер эксплантата в этом случае варьируется от 500 мкм до 1 см, и определяется возможностью получить стерильную культуру.
В любом случае верхушки после стерилизации промываются 4-5-кратно в стерильной воде (30-50 мин), помещаются в стерильные чашки Петри и заносятся в ламинар-бокс. Ламинар-бокс предварительно стерилизуют ультрафиолетом (за 2 ч до работы), поверхность стола и микроскопа протирают спиртом, включают ламинар-бокс на 15-20 мин.
Верхушку побега помещают стерильным пинцетом на предметный столик микроскопа, на который предварительно кладут стерильный фильтр. С помощью глазного скальпеля и иглы проводят выделение меристематической верхушки. Для чего верхушку побега располагают основанием к оператору, иглой придерживают основание верхушки, а скальпелем отрезают листочки, постепенно переворачивая верхушку иглой. После удаления 4-6 слоев необходимо осторожно и быстро отрезать меристематическую верхушку, состоящую из блестящего купола и субапикальной меристемы. Меристемагическую верхушку с 1-2 примордиальными листочками, поместить на иглу срезом вниз и посадить ее на питательную среду. Если сажают верхушки побегов, то достаточно удалить 1-2 слоя листьев. После посадки фильтр заменяют на новый, инструмент обжигают на спиртовке и помещают в сосуд со спиртом. Руки протирают спиртом. При работе нельзя допускать нахождения рук над предметным столиком микроскопа. После посадки эксплантата пробирки закрывают.
Способы размножения растений in vitro
Задание: Приготовить, простерилизовать и разлить питательные среды для размножения и укоренения побегов. Разделить конгломерат на отдельные побеги и посадить на питательную среду. Выделить культуры с признаками «стекловидности».
Ход работы: Если культуры (яблоня, ежевика и др.) на первых этапах размножения выделяют фенолы, то их размножают на питательных средах, содержащих активированный уголь (0,5-1 г/л) или антиокислители (аскорбиновая кислота, витамин Е, поливинилпиролидон 10-20 мг/л), либо на жидкой среде. Солевой состав питательной среды на первых пассажах должен быть бедным. Целесообразно использовать среды: Андерсона, Мак-Коуна, среду Мурасига-Скуга, в которой количество макро солей уменьшено в 2-4 раза. Первоначальное поведение эксплантатов зависит от вида, сорта, времени введения в культуру.
Первый этап считается завершенным после получения небольшого конгломерата побегов длиной 0,5-1,5 см. Для ягодных культур требуется затратить 1-3 месяца, для плодовых – 2-5 мес. Содержание цитокининов на первом этапе колеблется от 0,1 до 1 мг/л, ауксинов – от 0,01 до 1 мг/л.
Полученные побеги пересаживают на питательную среду с большей концентрацией солей и регуляторов роста. Как правило, используют полную среду Мурасига и Скуга, содержание цитокининов доводят до 1-5 мг/л. Очень часто необходимо корректировать содержание аммиачного и нитратного азота. Пересадки необходимо проводить через 3-4 недели либо культуры хранить в холодильнике. Жизнеспособность культур повышается, если конгломерат делят на отдельные части, содержащие 3-4 побега, а не один побег. Для некоторых культур оправдано горизонтальное расположение побегов при очередной пересадке.
|
|
Особое внимание необходимо уделить возникновению «стекловидности», или сверховодненности тканей, что можно определить по характерному блеску культур. Такие культуры выбраковываются, а условия культивирования (содержание агара, цитокининов, соотношение аммиачного и нитратного азота, колебания температуры) корректируются. Если культуры (яблоня, ежевика и др.) на первых этапах размножения выделяют фенолы, то их размножают на питательных средах, содержащих активированный уголь (0,5-1 г/л) или антиокислители (аскорбиновая кислота, витамин Е, поливинилпиролидон 10-20 мг/л), либо на жидкой среде. Солевой состав питательной среды на первых пассажах должен быть бедным. Целесообразно использовать среды: Андерсона, Мак-Коуна, среду Мурасига-Скуга, в которой количество макро солей уменьшено в 2-4 раза. Первоначальное поведение эксплантатов зависит от вида, сорта, времени введения в культуру.