Краткие методические указания для работы на практическом занятии

Высокочувствительным методом, основанном на сочетании электрофореза и ИФА (или РИА) является иммуноблоттинг (Вестерн-блонттинг) с помощью которого проводится идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченных антивидовых антител.

1. Иммуноблот с РИА. Антигены возбудителя (исследуемые антигены) сначала разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Полученные фракции переносят (блоттинг – от англ. blot – пятно) электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану, которая помещается в специальную камеру. Затем эти блоты обрабатывают специальными Ат к специфическому Аг, отмывают и добавляют радиоактивно меченный конъюгат для определения связавшихся с Аг Ат. Блоты помещают в кассету с рентгеновской пленкой и на проявленной пленке при положительной реакции видны полосы локализации Аг, связавшего меченные Ат.

2. Иммуноблот с ИФА. Фирмы выпускают коммерческие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации, отмывают от несвязавшихся Ат больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

При наличии в исследуемой сыворотке крови специфических антител к индивидуальным белкам возбудителя образуется видимый преципитат. Положительные реакции выглядят в виде ИФА – пятен, каждое из которых соответствует дискретной паре антиген – антитело. Единственное пятно позволяет усомниться в истиности результата.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это амплификация специфических последовательностей нуклеиновых кислот, с помощью которой в течение нескольких часов можно размножить нужную последовательность в миллионы раз. ПЦР позволяет осуществить такую амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, являющихся структурными элементами любой ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3´-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации - изолированное умножение гена или его фрагмента) специфической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров. Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий ДНК в исследуемом материале. Данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.

Достоинство:

1.Высокая чувствительность, позволяющая выявить даже единичные клетки возбудителя, независимо от их природы за 1-2 часа.

2.Высокая специфичность – выявляется характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3.Быстрота получения результата – весь процесс занимает 3-4 часа.

4.Использование при определении возбудителя непосредственно клинического материала, без специального выделения чистой культуры возбудителя и его подращивания.

5.Диагностика не только свежих, но и хронических форм инфекций. Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов.

6.Возможность выделения ДНК не только живых, но и убитых микроорганизмов.

Стадии метода ПЦР:

І. Выделение ДНК возбудителя из биологического материала.

ІІ. Амплификация ДНК (многократное копирование специфического фрагмента ДНК) – проводится в термоциклерах «Терцик – Украина» - специальный прибор с определенным температурным режимом для проведения циклов ПЦР, каждый из которых состоит из 3-х этапов:

1. Денатурация – нагревание реакционной смеси до 93-95⁰С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг (присоединение) – при наличии искомой ДНК-мишени праймеры отжигаются (присоединяются) к ДНК-мишени при температуре 60⁰С. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа (напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин). Когда отжиг праймеров произошел, Таq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК.

3. Синтез (элонгация) – доводят температуру в реакционной смеси до оптимума работы фермента (72⁰С). Синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью. В дальнейшем этап денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются до 30 и более раз. На каждом температурном цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Таким образом, данный метод основан на способности ДНК-полимеразы достраивать одноцепочечную ДНК с образованием двухцепочечной молекулы.

Праймеры – короткие искусственно синтезируемые молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.

Taq-полимераза – фермент, обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК

ІІІ. Детекция продуктов амплификации. Продукты ПЦР (ампликоны) идентифицируют при помощи гелевого электрофореза и результат реакции учитывают по свечению искомой ДНК возбудителя в УФ свете с помощью прибора - трансиллюминатора.

Конкретные цели:

· Объяснить преимущества применения серологических реакций с метками как экспресс – методов диагностики инфекционных заболеваний;

· Объяснить суть реакций и механизм проведения серологических реакций с метками;

· Проанализировать механизм проведения иммуноферметного анализа и сравнить с иммунохроматографическим анализом;

· Сравнить преимущества и недостатки ИФА и ИХА;

· Описать механизм проведения полимеразной цепной реакции;

· Изучить этапы проведения ПЦР;

· Перечислить достоинства ПЦР.

Уметь:

· Пояснить необходимость проведения серологических реакций с метками;

· Описать этапы проведения реакций с метками;

· Проанализировать механизм проведения РИА, ИФА и ИХА;

· Трактовать результаты серологических реакций с метками;

· Трактовать результаты ПЦР;

· Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

1. Определение понятия «серологические реакции с метками».

2. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.

3. Иммуноферментный анализ, иммуноблотинг. Механизм, компоненты, применение.

4. Механизм проведения радиоиммунного анализа.

5. Иммунохроматографический анализ. Принцип проведения.

6. Механизм полимеразной цепной реакции. Этапы проведения. Учет.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Разбор схемы постановки ИФА.

2. Разбор схемы постановки ИХА.

3. Оценка результатов реакций.

4. Разбор схемы постановки иммуноблоттинга.

5. Разбор схемы постановки РИА и РИФ.

6. Оценка результатов реакций.

7. Разбор схемы постановки ПЦР.

8. Оформление протокола.

Литература:

1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с анг. – М.: Мир, 2000.– 592с., с ил.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробъева.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов /Под ред. А.А. Воробъева, А.С. Быкова.– М.: МИА, 2003.– 236с.: ил.

6. Сучасні методи лабораторної діагностики інфекційних захворювань: Навч. посібник /За ред. акад. А.Я. Циганенка. Харків: Вид-во “Основа”, 2003.– 88 с.

7. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.: Медицинское информационное агенство, 2001. – 736 с.

2. Вершигора А.Е. Общая иммунология. - К.: Вища шк., 1990. - 635 с.

3. Воробьёв С.М., Северина Т.А. Создание иммуноферментной системы для определения гликопротеинов с использованием моноклональных антител // Биотехнология. - 1991.- № 4.- С. 82 - 85.

4. Егоров А.М., Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая шк., 1991. - 288 с.

5. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология: Руководство для врачей. - СПб: Питер, 2001. - 576с.

6. Иммунологические методы исследований /Швейцария. Базельский ин-т иммунологии; Под ред. И. Лефковитса, Перниса П.; Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.- 527с.

Краткие методические указания для работы на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из:

а) Разбора схемы постановки ИФА и оценки результатов реакции;

б) Разбора схемы постановки ИХА и оценки результатов реакции;

в) Разбора схемы постановки иммуноблоттинга и оценки результатов реакции;

г) Разбора схемы постановки ПЦР.

После анализа результатов реакций, записывают в протокол.

В конце занятия проводится оформление протокола, тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента.