Таблички по биореакторам

Лекция 3 Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде

План:

1. Понятие о суспензионной культуре; определение, техника получения первичной суспензии

2. Состав клеточной суспензии; особенности культивирования

3. Основные цитофизиологические параметры суспензионной культуры

4. Области использования суспензий

5. Понятие об одноклеточном клонировании

Рекомендуемая литература:

1. Рудишин С.Д. Основи біотехнологяп рослин. - Вінниця: 1998.-224 с.

2. Мельничук М.Д., Новак ТВ., Кунах В.Л. Біотехнологія рослин. Підручник. К.:ПоліграфКонсалтинг, 1003. -52с.

3. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Поли щук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. -К.: Наук. Думка. - 1980. -488с.

4. Биотехнология / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. – 3-я книга.

1. Понятие о суспензионной культуре; определение, техника получения первичной суспензии

Одним из важнейших биотехнологических объектов (которые используются во многих клеточных технологиях) является суспензионная культура.

Суспензионная культура - выращивание отдельных клеток или небольших групп клеток во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.

Процесс культивирования клеток в жидкой питательной среде называется глубинным культивированием, т. к. выращивание клеток происходит внутри, в жидкой среде.

Этим суспензия отличается от каллусной культуры, которая представляет собой поверхностное культивирование, при котором клетки выращиваются на поверхности твердой агаризованной питательной среды или на мостиках из фильтровальной бумаги. Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом. Здесь легче влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными (?) (внешними) факторами. Они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов.

По сравнению с каллусной культурой, суспензионная культура является более гомогенной (т.е. однородной), скорость роста клеток выше и обладает более высокими адаптивными способностями.

 

Способы получения первичной суспензионной культуры in vitro:

1. с использованием каллусной ткани. При этом небольшой участок каллуса в асептических условиях переносят в колбу с жидкой питательной средой. Колбу помещают на аппаратуру, обеспечивающую перемешивание и культивируют в течение 2-3 недель. Постепенно компактный участок каллуса разрыхляется и распадается на мелкие агрегаты и клетки. Пересев суспензионной культуры осуществляется в среднем, через 10-28 дней. Обычно в цикле выращивания суспензионной культуры растительных клеток биомасса увеличивается в 10-15 раз, а количество клеток в 3-4 раза.

2.с использованием фрагментоворганов растений. При этом фрагменты растений (молодые листья, реже стебли) в асептических условиях помещают в колбу с жидкой средой и культивируют в условиях, обеспечивающих перемешивание. Постепенно на поверхности экспланта образуется первичный каллус, его клетки отслаиваются в питательную среду, где делятся и дают начало суспензионной культуре. Однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени.

 

Аппаратура, используемая для культивирования суспензии, должна обеспечивать принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами, обеспечивая лучший газообмен и тем самым повышая эффективность культивирования. мы записали чуть выше, что аэрация и перемешивание – это необходимые условия глубинного культивирования.

Таблица «Культивирование сусп. к-р»

Используется два основных типа аппаратуры:

1. механические встряхиватели – к ним относятся роллеры, качалки.

Большинство моделей качалок позволяет осуществлять перемешивание в одном режиме – вращательном или возвратно-поступательном. Хотя наиболее современные модели (фирма «Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах перемешивания. При использовании роллерных установок –культивирование суспензий осуществляется в цилиндрических сосудах из боросиликатного стекла с небольшим количеством питательной среды, вращающихся со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоянное перемешивание питательной среды и интенсивный рост клеток. Для повышения эффективности массового культивирования установки обеспечены системой, дающей возможность заменять питательную среду и удалять суспензию без остановки вращения.

2. биореакторы (или ферментеры) – используются в промышленных условиях для культивирования суспензий в больших масштабах. Объем ферментеров варьирует от нескольких литров до 20 тыс. л. Типы биореакторов различаются в зависимости от способа перемешивания: механический, барботажный, аэролифтный. с механическими и магнитными мешалками или ферментёры барботажного типа, где и аэрация, и перемешивание осуществляются воздушным потоком.

Таблички по биореакторам

Ферментеры – это комплексы приборов и аппаратов для массового суспензионного или глубинного культивирования клеточных и бактериальных культур. В лабораторной практике ферментеры применяются для ведения научно-исследовательских работ или отработки технологии массового культивирования. В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-восстановительным потенциалом и другими параметрами.

Преимущества культивирования в таких биореакторах - большой объем; возможность длительного непрерывного культивирования; возможность управления процессами и автоматизации.

 

Преимущества глубинного культивирования:

1. Клетки и группы клеток непосредственно контактируя со средой, в равной степени получают питательные вещества (гормоны, витамины и др.)

2. Можно более точно манипулировать компонентами среды, управлять ростом клеток и контролировать их развитие.

3. Возможно проведение таких процедур как фильтрование, центрифугирование и др.

4. Пассирование и замена сред становится более технологичным процессом.

 

 

2. Состав клеточной суспензии; особенности культивирования

Суспензионная культура состоит из 2-х основных фракций: диссоциированной фракции (это фракция, состоящая из одиночных клеток меристематического и паренхимного типов) и агрегированной фракции (фракция, включающая мелкие клеточные агрегаты от 5-50 клеток и крупные, включающие более 50 клеток и имеющие размер до 2-3 мм). (! Будет в тестах!)

Из первичной суспензионной культуры через несколько пассажей образуется вторичная суспензионная культура, которую, также как и каллусную, необходимо периодически пассировать, т. е. (?) переносить на свежую питательную среду.

Часть суспензии, переносимая на свежую питательную среду называется инокулюм.

Биотехн_1 Егоров Стр 59 почитать И 3 кн_стр 21

Нарисовать пример

Для глубинного культивирования растительных клеток используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания клеточная масса (инокулюм) перемещается в определенный объем среды. До конца выращивания система остается закрытой по всем параметрам, кроме газового. В закрытой непрерывной культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

В открытые проточные культуры периодически или непрерывно поступает свежая питательная среда, а отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы. Регулируется объем добавляемой и отбираемой питательной среды за счет оптической системы, определяющей плотность клеток (режим турбидостата) или по соотношению в среде важнейших элементов питания (режим хемостата).

 

В лабораторных условиях наиболее распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система.

 

Поэтому используют 2 основных способа субкультивирования суспензий:

1). Пипеткой из колбы отбирают необходимое количество гомогенной суспензии (инокулюм) и переносят его в другую колбу на свежую питательную среду. (! Все работы, связанные с культивированием in vitro проводятся в асептических условиях!)

2). Из колбы с суспензией аккуратно сливают диссоциированную фракцию, а к агрегированному осадку добавляют свежую питательную среду.

После этого продолжают культивирование суспензий на качалке (где?) в культуральной комнате. Добавление свежей среды стимулирует деление клеток в агрегированной фракции и отслоение одиночных клеток в среду.

Состав питательных сред для культивирования - чаще тот же, что и для каллусной культуры, но иногда для поддержания высокой диссоциации увеличивают концентрацию 2,4-Д, добавляют ферменты, изменяют соотношение углеводов.

 

Факторы, влияющие на процессы ростового цикла

Интенсивность процессов ростового цикла зависит:

1. от вида растения,

2. объема инокулюма,

3. условий культивирования (состав среды, значение рН, температура, состав газовой фазы и скорость перемешивания).

Культивирование суспензий, как и любого другого биотехнологического объекта, проводится в контролируемых условиях: температура + 26°С; 70% влажности; скорость перемешивания (частота вращения качалок) – 100-120 об/мин; освещение с фотопериодом 16 часов от 600 люкс до 2-3 тыс. люкс в зависимости от культуры.

3. Основные цитофизиологические параметры суспензионной культуры

Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их массы.

Кривая роста также имеет (какую?) S-образную форму. На ней различают 1- латентную фазу, в которой видимый рост инокулюма еще не наблюдается;

2- экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с ускорением;

3- линейную, в которой скорость роста постоянна;

4- фазу замедленного роста;

5- стационарную фазу;

и 6- фазу деградации клеток.

 

Для учета роста и функционирования суспензионной культуры используются различные параметры, которые позволяют судить о состоянии популяции изолированных клеток. Многие из этих параметров такие же, как и для каллуса.

1. Плотность суспензионной культуры – это число клеток в мл суспензии. Это основной показатель роста суспензии, именно по нему строят у суспензий кривые роста в цикле выращивания (S-образную кривую).

Для определения плотности вначале суспензию диспергируют (разделяют) для распада клеточных агрегатов до одиночных клеток (5-10% хромовой кислотой при 60°С в течение 30-40 мин). Получившуюся смесь клеток пипеткой помещают в специальную камеру Фукса-Розенталя. Под микроскопом подсчитывают число клеток в камере и затем по формуле пересчитывают плотность (т.е. число клеток/мл) суспензии.

 

2. Агрегированность - это соотношение разных типов клеточных агрегатов, выраженное в %.

Для определения под микроскопом просматривают предварительно окрашенную суспензию и определяют в % соотношении следующие типы агрегатов: 1) одиночные клетки; 2)агрегаты, состоящие из 2-5 клеток; 3) 6-20 клеток; 4) 21-50 клеток; 5) более 50 клеток.

Хорошей суспензией, подходящей для выделения одиночных клеток, считается суспензия, содержащая 30-40% одиночных клеток.

 

3. Объем осажденных клеток - это объем биомассы клеток в % по отношению к общему объему суспензии. Для определения этого показателя определенный объем суспензии (20-30 мл) переносят в мерную пробирку и центрифугируют ее при 200 оборотах в течение 5 мин), а затем определяют в % количество осадка от общего объема культуры.

 

4. Масса сырого вещества - также важная характеристика роста суспензии. Для определения суспензию пропускают через предварительно взвешенный фильтр из нейлоновой ткани. Затем фильтр взвешивают и определяют сырую биомассу. Этот показатель обычно определяют в конце пассажа.

Вес сухого вещества определяют после просушивания определенной навески сырой биомассы при 60-70 °С в течение суток.

 

6. Жизнеспособность клеточной суспензии – это количество живых клеток от общего числа клеток, выраженное в %. Жизнеспособные культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителями.

Это показатель определяют почти также как и для каллуса - несколько капель суспензии на предметном стекле окрашивают 0,1% метиленовым синим. После такой окраски живые клетки остаются светлыми, а мертвые становятся синими. Окрашивание мертвых клеток происходит из-за нарушения проницаемости клеточной оболочки и гибели ядра и органелл, в результате чего краситель попадает в клетку. Под микроскопом подсчитывают число живых и мертвых клеток и определяют % жизнеспособности. У хорошо растущей суспензионной культуры на линейной фазе роста жизнеспособность достигает 60 - 80%.

4. Области использования суспензионной культуры

Суспензионные культуры могут использоваться:

1. как модельные системы для генетических экспериментов и изучения физиологических и биохимических процессов, т.е. для решения теоретических вопросов.

2. Для выделения одиночных клеток и одноклеточного клонирования – разберем чуть ниже.

3. В клеточных технологиях - мутагенез in vitro, клеточная селекция – для отбора генотипов, обладающих хозяйственно-ценными признаками и для отбора устойчивых клеточных популяций. Для этих целей в суспензионной культуре создают селективные условия: повышение концентрации солей в среде, ионов тяжелых металлов, гербицидов, токсинов, водный и солевой стресс, экстремальные температурные условия (низкие или высокие температуры), введение в среду токсических метаболитов фитопатогенов.

4. Для биосинтеза вторичных метаболитов – так как это более технологичный объект и имеет много преимуществ (возможность культивирования в больших объемах и легче управлять и выделять БАВ). Насчитывается более 50 групп вторичных метаболитов, которые продуцируются культурами клеток растений (алкалоиды, аминокислоты, антилейкемические агенты, антимикробные агенты, белки, витамины, душистые вещества, иммунохимикаты, масла, красители, инсулинподобные вещества, пищевые добавки, терпены и терпеноиды и т.д.)

5. Для биотрансформации химических соединений (например, трансформация β-метилдигитоксина в β-метилдигоксин клетками Datura (Дурман). При этом стоимость продукта в 500 раз превышает стоимость субстрата и альтернативного химического или микробиологического способа его получения не существует.

6. Для получения протопластов (используют суспензии с большим % одиночных клеток).

 

5. Понятие об одноклеточном клонировании

Клон (?) – популяция клеток, возникших из одной клетки.

Одноклеточное клонирование - получение культур из одной клетки.

Получение одноклеточных клонов широко используется в клеточной и генной инженерии. Оно необходимо при выделении мутантных клеток в клеточной селекции при получении устойчивых растений-регенерантов, а также выделении продуктивных клеточных линий с БАВ. В генной инженерии при переносе генетической информации в клетку также необходимо подбирать условия для роста из одной клетки каллуса и регенерации из них растений.

Получение одноклеточных клонов состоит из 2 этапов:

1. Получение одноклеточной фракции (то есть получение, изолирование одиночных жизнеспособных клеток). Для этого чаще всего используют суспензию с высоким % одиночных клеток, из которой затем выделяют одноклеточную фракцию. Также применяют отстаивание суспензии в цилиндре в течение 15-30 мин. (крупные агрегаты оседают, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты).

2. Получение индивидуальных клонов (т.е. создание благоприятных условий для роста и деления одиночных клеток и развития из них культур).

 

Существует несколько методов, позволяющих выращивать одиночные клетки in vitro и получать из них клоны:

Метод микрокультуры.

Метод основан на асептическом культивировании одиночных клеток в капле жидкой среды в специально сконструированных микрокамерах.

Для этого под микроскопом одиночные клетки отбирают микропипеткой и помещают на питательную среду в микрокамеры. При этом объем питательной среды должен быть минимальным (микрокапли объемом 20 мкл). Этот метод открывает широкие возможности для наблюдения за делением и ростом одиночных клеток с использованием микрофотографии.

2. Метод пластинок (метод Плейтинга) - заключается в высеве клеток в обогащенную агаризованную питательную среду. Что такое «обогащенные среды»? это питательные среды – с повышенным содержанием АК, витаминов, гидролизата казеина (среда Као).

Для этого готовую агаризированную среду (с удвоенным % агара - 1,4-1,6%)  нагревают для расплавления агара и остужают до +35°С (?) (чтобы не травмировать клетки). Суспензию одиночных клеток отливают в стакан и в соотношении 1:1 смешивают с питательной средой. Полученную смесь разливают в чашки Петри очень тонким слоем (1-2 мм). Чашки Петри запечатывают парафилмом и культивируют во влажной камере (с влажностью 70%). Через 2-3 недели их просматривают, определяют рост колоний и эффективность высева. Как правило, эффективность образования колоний при таком способе очень низка и равна 0,3 – 0,5 %.

 

Кроме того, для стимуляции деления отдельных клеток используют также гомологичную ткань «няньку» (кормящий слой).

3. В основе метода культуры нянек лежит использование активно делящихся каллусных культур (нянек) для инициации роста одиночных клеток. Для создания «кормящего слоя» берут каллус того же вида растения, что и одиночная клетка или близкого вида в экспоненциальной (?) фазе ростового цикла.

Выращивание одиночных клеток тканями-няньками возможно несколькими способами:

1). Кусочек фильтровальной бумаги, смоченный в питательной среде помещают на поверхность хорошо растущей в колбе ткани-няньки. Через 2-3 дня на фильтр переносят пипеткой одиночные клетки. В чашку необходимо периодически добавлять жидкую питательную среду, чтобы фильтровальная бумага была смоченной. По мере старения ткани-няньки фильтр можно переносить на свежую ткань-няньку или по мере роста колоний их переносят для доращивания на свежую агаризованную среду в колбу.

2). В чашку Петри с питательной средой и кусочками ткани-няньки помещают ванночки из нержавеющей стали, размером 50 х 50 мм (на ножках) с перфорированным дном, на которое кладут фильтровальную бумагу, а сверху капают суспензию с одиночными клетками. Объем среды в ванночках и чашках должен быть одинаковым и не должен превышать в толщину 1-2 мм (20 мл среды в чашках и 3 мл среды в ванночках). По мере роста колоний их снимают и переносят на свежую среду в колбу.

 

Используя одноклеточное клонирование можно отбирать отдельные мутантные клетки, обладающие полезными признаками – устойчивые к болезням, абиотическим стрессам, с необычным числом хромосом, что и используется в клеточной селекции.