Уровень (4-17)

4. Важное достижение медицины последних лет — разработка и клиническое использование биологических препаратов, созданных на основе моноклональных антител. Первые моноклональные антитела использовали в основном с диагностической целью. Именно с помощью моноклональных антител к поверхностным молекулам определяют субпопуляционный состав лимфоцитов, проводят иммуногистохимические исследования для диагностики онкологических и аутоиммунных заболеваний при работе с материалами биопсии. С помощью цитолитических моноклональных антител проводят сортировку клеток для выделения нужной популяции (например, выделение стволовых кроветворных клеток для трансплантаций). Возможно создание моноклональных антител к антигенам вирусов, бактерий и других патогенов для лечения инфекционных заболеваний. Области применения моноклональных антител: • с диагностической целью: определение экспрессии различных молекул; • блокада рецепторов; • инактивация и лизис клеток (лечение онкологических и аутоиммунных заболеваний). Сначала были созданы гетероиммунные антитела (мышиные античеловеческие, овечьи антимышиные и т.д.). Их используют в основном для диагностических целей и селекции клеток. При введении в организм человека они вызывают выработку антител. Препараты для клинического использования были созданы для обеспечения высокоспецифичного, высокоаффинного сродства моноклональных антител с антигеном в сочетании с минимизацией побочных эффектов, в частности выработки пациентом антител к чужеродному белку. Таким образом, антитело человека становится носителем антигенсвязывающего фрагмента мышиного иммуноглобулина. Эти препараты на 75% состоят из белка человека и на 25% — из белка мыши. Такая структура обеспечивает высокое сродство к антигену и уменьшает (хотя и не исключает) возможность образования против них антител организмом хозяина, что может вызвать серьезные побочные реакции, вплоть до развития анафилаксии. Пример химерного антитела — препарат ремикейд (инфликсимаб). Следующим шагом стало создание гуманизированных моноклональных антител, на 80-95% состоящих из белка человека и только на 5-10% — из белка мыши. Мышиного происхождения в этих молекулах — только гипервариабельные участки, формирующие антигенсвязывающий центр. Наконец, были созданы генно-инженерные, полностью гуманизированные моноклональные антитела, молекулы которых полностью состоят из белка человека. Большинство препаратов на основе моноклональных антител пациенты переносят хорошо. При использовании химерных возможна выработка антител к ним и развитие анафилактических реакций. Препараты, подавляющие функции и уменьшающие количество различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, могут вызвать снижение противоинфекционной резистентности и/или обострение хронических инфекций. Для предотвращения этих осложнений необходимо тщательное наблюдение за пациентами, получающими лечение препаратами на основе моноклональных антител, и своевременное назначение адекватной сопроводительной терапии. Те же меры предосторожности необходимо предпринимать для уменьшения риска и тяжести течения токсических реакций, описанных при применении моноклональных антител для лечения онкологических заболеваний (например, препаратов, подавляющих ангиогенез). При лечении антителами против ФНО-ot возможна активация скрытого туберкулеза. Перспективное направление в создании новых препаратов на основе моноклональных антител — каталитические антитела абзимы. Это молекулы, обладающие свойствами антител (могут связываться с определенными эпитопами) и биологических катализаторов различных химических реакций (энзимов). Области применения абзимов: • Диагностика аутоиммунных заболеваний (анти-ДНК аутоантитела с каталитической активностью). • Лечение аутоиммунных заболеваний. • Лечение инфекционных заболеваний (создание абзимов, направленных на специфический катализ инфекционных агентов).

Наиболее широко используются моноклональные антитела в медицинской диагностике. Разработаны сумки-укладки для постановки диагнозов. Если к антителами присоединить радиоактивные или магнитоактивные материалы и ввести их в живой организм, то можно выявить в нем патологические зоны. Такие МКА присоединяются к пораженным болезнью клеткам организма, а соответствующие индикаторные материалы позволяют выяснить их местонахождение.

МКА используются и в процессах очистки веществ. Современные технологии основаны на присоединении антител к твердой матрице носителя. К ним добавляют смесь молекул, содержащую искомый антиген. Затем комплексы антиген - антитело отмываются от примесей, не связанных с матрицей. После разрушения ковалентных связей антиген - антитело в растворе остаются свободные антигены.

Если получить антитела определенного типа и иммунизировать ими животное, то образуются анти-антитела (анти-идиотипные антитела). Они действуют на иммунную систему как псевдоантиген и поэтому могут быть использованы для ее стимуляции. На этом принципе основано получение вакцин нового типа. Наборы МКА могут быть также предназначены для борьбы с аллергенами.

Моноклональные антитела и “мишенная” лекарственная терапия. Предполагается, что большое разнообразие раковых заболеваний обусловлено активацией эндогенных генов, вызванной химическими агентами, внутренними хромосомными перестройками. Эти гены кодируют определенные белки, и поэтому раковые клетки могут содержать уникальные белки на поверхности клетки. Возможно, именно эти белки участвуют в супрессии роста здоровых клеток. Инактивируя эти белки, можно тормозить рост раковых клеток.

Благодаря высокий специфичности МКА широко используются в качестве зондов для точного определения природы молекул поверхности клеток и клеточных органелл. С их помощью также можно проводить детекцию активности ферментов.

Методы иммуноферментного анализа применяют в диагностике вирусных заболеваний растений. Это позволяет сократить время получения безвирусного посадочного материала, отбирать новые вирусоустойчивые сорта. При генно-инженерных экспериментах можно быстро отбирать клоны - продуценты.

5. Слияние клеток лежит в основе получения гибридных клеток, продуцирующих антитела. Антитела - белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. В совокупности называемые иммуноглобулинами (Ig), антитела составляют один из главных белковых компонентов крови - по весу около 20% суммарного белка плазмы.

В качестве антигенов выступают различные вещества: клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, в некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получивших название антигенных детерминант. В случае белковой молекулы антигенной детерминантой являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков.

Простейшие молекулы антител имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены: Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок:

Тенденция больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) удобна для выявления антител и антигенов. Образование таких комплексов может приводить к агглютинации (склеиванию) молекул. Это явление лежит в основе определения групп крови, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности - реакция гемагглютинации.

Молекула антитела образована четырьмя полипептидными цепями (рис. 33).

Две из них - идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две - тяжелые (H-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидыми) связями. Антиген-связывающие участки образуются за счет одной H и одной L-цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на H-цепи. H-цепь образует также “хвостовой” участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами.

6. Процесс стерилизации интактного растительного материала, из которого в дальнейшем вычленяют экспланты (группы клеток, ткани или целые органы), необходимо производить с особой тщательностью, поскольку от этого зависит, будет ли эксплант развиваться или погибнет от инфекции. Однако часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибковой и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растительного материала бензоатом натрия. Более того, необходим тщательный фитосанитарный уход за исходными растениями.

Процесс стерилизации растительного материала можно условно разделить на несколько этапов. На первом этапе отобранные интактные части растений механически очищают от лишних частей (чешуйчатые листья, основания сидячих листьев и пр.). Затем растительный материал тщательно (2-3 раза) промывают под проточной водой и в слабом растворе калийного мыла, опять ополаскивают проточной водой. После этого части растений разрезают на сегменты такого размера, чтобы они могли свободно помещаться в сосуды со стерилизаторами, и заливают дистиллированной водой. Затем переходят ко второму этапу стерилизации, который, как правило, проводится уже в ламинарном боксе.

Меристемы изолируют под бинокулярным микроскопом или с использованием лупы. Препаративной иглой или хирургическим скальпелем отодвигают листья (оболочки) и вырезают меристему с помощью 4 надрезов вокруг бугорка, а потом подрезают снизу. После вычленения эксплант помещают в сосуд с питательной средой и переносят в культуральное помещение.

Второй этап — это собственно стерилизация, которую удобно проводить в следующей последовательности.

В ламинарном боксе расставляют необходимое количество стерильных стаканов на 250 мл, которые сверху накрывают простерилизованными половинками чашек Петри. В стаканы в той очередности, в которой будут проводиться стерилизационные мероприятия, наливают растворы стерилизаторов, чередуя их со стаканами, наполненными стерильной дистиллированной водой.

В растворы можно добавлять по несколько капель так называемых увлажнителей/прилипателей (tween-20, citowett, sandowit) для снижения поверхностного натяжения и улучшения смачиваемости поверхности эксплантов. После обработки хлор- и ртутьсодержащими препаратами необходимо осуществлять двухкратную промывку стерильной водой. Стерилизация начинается со стакана с 70%-ым этиловым спиртом и заканчивается 1-2 стаканами со стерильной дистиллированной водой для промывки. Растительные объекты удобно помещать в отдельные стерильные марлевые мешочки – это существенно упрощает процесс стерилизации. Мешочки, прошедшие серию растворов-стерилизаторов, раскладывают между стерильными салфетками из фильтровальной бумаги для удаления лишней влаги.

На заключительном этапе стерильным инструментом вычленяют интересующие участки растительных тканей и переносят их на питательную среду. Для обеспечения максимальной стерильности все манипуляции удобно проводить на стерильных одноразовых салфетках из фильтровальной бумаги. Перед вычленением каждого экспланта инструмент необходимо обжечь в пламени горелки. Удобно иметь набор скальпелей и пинцетов (20-30 штук), который лучше всего хранить в специальных конвертах из бумаги “крафт”. Экспланты помещают в отдельные емкости; чаще это сахарные пробирки или небольшие колбы с минимальным объемом питательной среды.

Для стерилизации семян и органов интактных растений используют различные вещества. Наиболее применяемы в практике растворы, содержащие активный хлор: гипохлорид кальция и натрия, хлорная известь, хлорамин. Следует подбирать такие концентрации, которые не повреждали бы ткани, не воздействовали на всхожесть семян и одновременно обеспечивали максимальную стерильность растительных образцов.

Часто для стерилизации применяют растворы соединений ртути – сулему, диацид, famosept, thimerosal. Эти вещества при правильном выборе концентрации и экспозиции дают удовлетворительные результаты, несмотря на их токсичность для растительных тканей. После стерилизации в ртутьсодержащих препаратах необходима тщательная промывка в 3-4 порциях стерильной дистиллированной воды. Кроме того, отработанные растворы требуют соответствующей утилизации. В качестве стерилизующего агента также применяют пероксид водорода (Н202), который, менее всего повреждает ткани; после его применения отпадает необходимость продолжительной промывки, так как это вещество быстро разлагается.

При введении в культуру in vitro иногда наблюдается побурение тканей экспланта, возникающее в результате механических повреждений отдельных тканей как результат окисления фенолов, что характерно для многих видов. В дальнейшем это приводит к отмиранию эксплантов. Для удаления фенолов в воду для промывки можно добавлять 1-10%-й раствор L-цистеина, а процесс вычленения проводить в стерильном растворе аскорбиновой кислоты в чашках Петри.

7. В процессе пересадки (субкультивирования) каллус переносят из колбы или пробирки в стерильную чашку Петри. После асептического отделения старых некротизированных участков и кусочков приставшей агаризованной среды, каллус разделяют на равные части, которые переносят в колбы или пробирки со средой. Интенсивность роста отдельных каллусов одного и того же варианта может значительно варьировать. Эта вариабельность зависит от того, что трансплантаты берут с различных участков исходного каллуса и с разных каллусов. Поэтому отдельные варианты опытов с каллусными культурами должны иметь не менее шести повторностей (Калинин и др., 1980).

Каллусные культуры очень различаются по интенсивности роста, по консистенции, окраске, способности зеленеть на свету и другим свойствам. Клеточные колонии на агаризованной среде могут быть компактными и твердыми, а также рыхлыми, которые при извлечении каллуса распадаются на кусочки. Последний тип каллусов в жидкой среде очень легко отделяет одиночные клетки и дает начало суспензионной культуре. Отмечено, что компактные каллусы могут давать начало рыхлым тканям, но не наоборот (Reinert, White, 1956; Torrey, Shigemura, 1957). Морфологические особенности и консистенция каллуса легко изменяются под действием различных веществ, вводимых в питательную среду и вызывающих изменение метаболизма и, соответственно, морфогенеза тканей. Так, выращивание нормальной ткани партеноциссуса, табака и моркови на среде, содержащей 2,4-Д и кокосовое молоко, приводило к росту по типу рыхлой, бесформенной колонии, тогда как вь1ращивание на среде с ИУК определяло компактный рост ткани (Бутенко, 1964). Анатомическая структура рыхлых каллусов характеризуется множеством организованных центров меристематической активности, разделенных большими недифференцированными клетками. Плотные каллусы менее дифференцированы и содержат много крупных вакуолизированных клеток (Blakely, Steward, 1961; Grant, Fuller, 1968). Существует разница между этими типами каллусов в упаковке клеток: плотные каллусы состоят из тесно упакованных клеток. Обнаружены различия в химическом составе: у плотных каллусов общее количество полисахаридов клеточной стенки выше, но снижен процент содержания целлюлозы по сравнению с пектиновыми веществами и гемицеллюлозами.

По современным представлениям, каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы каллусной ткани может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов.

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают

Ø рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на отдельные клетки;

Ø средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

Ø плотными, с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном, трахеиподобных элементов).

Как правило, в длительной пересадочной культуре на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина - 2,4-Д, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.

В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дедифференцируются как зрелые каллусные клетки и, наконец, деградируют.

Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, из них получают суспензии клеток, растущих в жидкой питательной среде. Как правило, для регенерации растений предпочитают также каллусные ткани.

Важную роль при выращивании тканевых культур имеют температурные условия, а также интенсивность, продолжительность и качество освещения. Анализ многочисленных экспериментальных данных показал, что для большинства тканей температурный оптимум 24-27°С, с отклонением от него на 2-3°С для отдельных тканей (Бутенко, 1964). При культивировании нормальной каллусной ткани моркови в условиях фитотрона на искусственном свету было показано, что оптимальная температура для их выращивания 20°C (Capite, 1955).

При изучении роста и развития каллусных тканей применяются качественные и количественные критерии. Качественные оценки применяются при изучении процесса каллусообразования из кусочков изолированных тканей, процесса гистогенеза в связи с каллусообразованием и в пассированной культуре, процессов органогенеза в недифференцированной культуре ткани и корреляций между органами при их образовании. Количественные критерии применяются при изучении действия на рост культуры различных внешних факторов. С этой целью используют обычно определение сырого и сухого веса культур, определение поверхности выросшей массы, подсчет числа клеток и определение прироста белкового азота.

8. Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием, затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре, переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля. В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста (клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны).

После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов. Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности, добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз, отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 104-105/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности.

Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 оС.

9. Зимерман с сотрудниками в 1981 году разработали физический метод слияния протопластов, в котором как индуктор слияния используют импульсы электрического тока. Протопласты помещают в камеру, где создается неоднородное, переменное электрическое поле. В этих условиях на электродах формируются агрегаты, состоящие из 2 - 3 протопластов, или между электродами формируются "цепочки" из 5 - 6 протопластов (это явление известно как диелектрофорез). К этой системе дополнительно прилагается единичный импульс, который вызывает слияния протопластов в агрегате. Все физические параметры подбираются индивидуально. Слияние происходит при удельной электропроводности среды ниже 10-4 См / см. Это условие удовлетворяет 0,5 М раствор маннита, который относится к неэлектролитов: его удельная электропроводность 1,410-5 См / см.

Слияние, индуцированной электрическим током, имеет следующее объяснение: импульс короткой продолжительности вызывает разрушение мембран протопластов, соприкасающихся. Вокруг "дыры" возможен обмен липидными молекулами, образования липидных мостиков приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгоден состояние, чем существование двух поврежденных мембран.

Эффективность електрозлиття зависит от возраста растения, происхождения протопластов, их размеров, длины "цепочки", плотности суспензии протопластов, продолжительности действия одиночного импульса.

Для автоматизации процедуры електрозлиття изолированных протопластов разработана и уже применяется ряд установок. Например, Electro Cell Manipulator 200 (США), или установка, созданная НПО "Корна" (Россия). Эти установки состоят из генератора напряжения, генератора одиночных импульсов, усилителя мощности, кювет с платиновыми электродами.

Итак, во всех методах слияния протопластов на первом этапе происходит их агрегация.

Анализ экспериментальных материалов, касающихся структуры и свойств мембран при воздействии индукторов слияния, показывает, что в условиях высокого рН, под действием высоких концентраций Са2 + в растительных протопластов происходит увеличение текучести мембран. ПЭГ не вызывает увеличения текучести мембран, а способствует агрегации протопластов.

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием техники культивирования клеток in vitro, что дает возможность получения изолированных протопластов, их культивирования, образования каллуса, а в дальнейшем целого растения, сформировали новый и перспективный метод гибридизации растений-парасексуальными, или соматическую гибридизацию.

Соматическая гибридизация - гибридизация растений в обход полового скрещивания, при которой как родительские клетки изолированных протопласты соматических клеток или клетки, культивируемые in vitro.

Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, получать асимметричные гибриды. В отличие от полового скрещивания, где происходит одностороннее исключение протоплазмы, при соматической гибридизации в образованном гибриде оба партнера имеют относительно ровный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух разных цитоплазмы. В большинстве случаев слияния изолированных протопластов приводит к образованию или гибрида, или цибридов (цитоплазматического гибрида). Цибридных клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро - одного. Образование растений с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но с ядром только одного вида возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует. Образование цибридов возможно и в том случае, когда один из протопластов лишен ядра или оно инактивированные путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, которые несут признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенов.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca i N. Langsdorfii. Одним из самых интересных соматических гибридов является pomato - гибрид картофеля и томата, полученный в 1978 г. И хотя этот гибрид пока стерильный, а диаметр его плодов не превышает 3 мм, само его существование привлекает внимание к методу прогрессивных селекционеров.

На сегодня методами соматической гибридизации получены внутривидовые (дурмана, петунии и др.)., Межвидовые (петунии, моркови, дурмана, картофеля), межродовые (томаты + картофель; арабидопсиса + турнепс; дурман + красавка) и межсемейное гибриды (горох + табак; лук + табак). Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким способом, в определенной мере, ненормальные. Например соматический гибрид между арабидопсиса и турнепсом, который является растением-монстром. Аномалии, возникающие является результатом хромосомной несбалансированности.

Особый интерес представляют мижцарственни гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопласты моркови и человека, табака и человека и другие.

10. Дробное (фракционированное) осаждение. Один и тот же реактив часто образует малорастворимые соединения не с одним, а с несколькими ионами, присутствующими в растворе. Применяя правило произведения растворимости, можно проследить последовательность осаждения ионов. Первым осаждается соединение, у которого произведение растворимости меньше. Первым фактором, определяющим направление и полноту протекания реакции двойного обмена, является растворимость образующихся веществ. Чем меньше она будет, тем полнее пойдет реакция в сторону практически полного осаждения его из раствора. Если при реакции может получиться не одно, а несколько различных малорастворимых веществ, то пойдет дробное (фракционированное) осаждение.

Для очистки кислоты применятся метод дробной (фракционированной) перегонки При такой перегонке собираются отдельно 2 фракции а) водный погон при температуре до 60° и вакууме 730— 740 мм и в) чистая кислота — при температуре от 60 до 90° н вакууме 730—740 мм.

Комбинированные способы кристаллизации — вакуум-кристаллизация, кристаллизация с испарением части растворителя в токе носителя (обычно воздуха) и дробная фракционированная) кристаллизация.

Многократным дробным фракционированием через пористые трубки Г е р ц у <(1932).и его сотруднику Га рм сену (1933) впервые удалось почти полностью разделить изотопы неона Ne o и Этим же путем Герц отделил в чистом виде изотоп водорода (см. ниже). 

Дробное (фракционированное) осаждение. Один и тот же реактив часто образует малорастворимые соединения не с одним, а с несколькими ионами, присутствующими в растворе. Применяя правило произведения растворимости, можно проследить последовательность осаждения ионов. Первым осаждается соединение, у которого произведение растворимости меньше. Это происходит потому, что для образования осадка этого соединения требуется меньшая концентрация реагента.

В случае, соответствующем рис. VI.5, Ра/Рх >1- Отсюда Nl/N[ больше отношения Л г/А ь т. е. мольная доля более летучего вещества (втор(зго) в паровой смеси больше, чем в жидкости. Поэтому подобные растворы можно разделять на составляющие их вещества путем их дробной (фракционированной) перегонки. Для этого раствор нагревают до кипения, а образовавшийся пар пропускают через холодильник. Конденсирующаяся при этом жидкость обогащена легкокилящим веществом. Ее собирают отдельными порциями (фракциями) и вновь подвергают перегонке. Получаемый при этом конденсат еще сильнее обогащен легкокипящ1- м веществом, а оставшаяся жидкость — низкокипящим. Многократное повторение таких операций приводит к разделению смесей. В промышленной практике подобные процессы ведут непрерывно. Для некоторых пар веществ, однако, такое разделение имеет определенные пределы. При их достижении раствор испаряется как чистая жидкость, т. е. без изменения состава. Подобные системы называются азео-тропными.

Дробная (фракционированная) перегонка, характеризируется тем, что при перегонке следят за температурой кипения смеси и По.

11. Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур или оболочки), то он является эндометаболитом, если выделяется клеткой в культуральную жидкость - экзометаболитом.

В большинстве случаев извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов из культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.

Для отделения бактериальных культур применяются вакуум-фильтры: нутч-фильтры, ленточные, барабанные, камерные. Фильтрование бактериальных суспензий сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены малым размером клеток, высокой вязкостью суспензий и наличием большого количества примесей микрочастиц. Поэтому стадии фильтрования обычно предшествует предварительная обработка суспензий с целью максимально возможной коагуляции клеток и примесей в более крупные и легко фильтруемые частицы. Применяются несколько видов коагуляции: тепловая, органическими и неорганическими кислотами, неорганическими солевыми электролитами (Na2SiO3, Na2HPO4), которые взаимодействуют с ионами Са2+, находящимися в культуральной жидкости, с образованием труднорастворимых соединений.

Ca2+ + Na2SiO3 * CaSiO3* + 2Na+

Ca2+ + Na2HPO4 * CaHPO4* + 2Na+

Образующиеся частицы осадка захватывают клетки микроорганизмов и примеси.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов, таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляция. Эффективным методом коагуляции суспензий является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флоккулы, или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Образующиеся в результате коагуляции и флокуляции крупные частицы перед фильтрованием могут быть подвергнуты седиментации (осаждению под действием силы тяжести) с последующей декантацией надосадочной жидкости, которая далее может быть дополнительно очищена фильтрованием.

Осадки большинства микробных клеток относятся к разряду сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скорость фильтрации будет заметно уменьшаться. Для облегчения фильтрации микробных суспензий и уменьшения перепадов в скоростях фильтрации используют барабанный фильтр с намывным слоем - аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность барабана намывают дренажный слой наполнителя, представляющего собой порошок диатомита, фильтрперлита (размолотые вулканические породы, содержащие SiO2 и Al2O3) или древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от обычного вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя, таким образом, фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается.

Для предварительного концентрирования (сгущения) более крупных и тяжелых клеток дрожжей и микрогрибов широко используют флотацию. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы клетки. Процесс проводят в специальных аппаратах - флотаторах, в которых нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят и выводят сконцентрированную в 4-6 раз суспензию клеток (получение пекарских дрожжей).

Для последующего концентрирования и отделения биомассы грибов и дрожжей используют сепарирование (одноступенчатое или многоступенчатое) для разделения суспензий и эмульсий, а так же центрифугирование для отделения твердых осадков и клеток от культуральной жидкости. Так для сгущения суспензии дрожжей от 20-30 г/л до 550-600 г/л с помощью сепаратора- сгустителя непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501 К-3, необходимо последовательное сепарирование в 2-3 ступени. С помощью центрифуг различных конструкций удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Наличие в культуральной жидкости высоковязких компонентов, таких как различные экзополисахариды типа декстрана, аубазидана, пуллулана и др. существенно затрудняет процесс центрифугирования.

Для извлечения целевых продуктов эндометаболитов из концентрата микробной биомассы ее либо обрабатывают каким-либо экстрагентом без разрушения клеток (экстракция петролейным эфиром биожира из кормовой биомассы дрожжей, извлечение полиеновых антибиотиков), либо клетки разрушают каким-либо из методов, а затем экстрагируют продукты.

Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор методов, которые можно отнести к трем основным группам: физико-механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует.

К физическим методам относятся: разрушение клеток баллисти-ческим способом с применением бус баллотини, кварцевого песка, растирание клеток в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование клеток под высоким давлением (2-5 атм) через узкую щель или отверстие; газодекомпрессион-ная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция. Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бакте-риальных клеток; ферментного комплекса, содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов.

Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.

Выбор метода дезинтеграции определяется целью работы: для получения внутриклеточных ферментов наиболее приемлемы баллистические и экструзионные способы; энзиматические методы широко применяют в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к нарушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.

В результате обработки клеточной биомассы по одному из методов дезинтеграции получают гомогенат, содержащий неразрушенные клетки, оболочки разрушенных клеток, обрывки мембран, различные клеточные структуры, которые могут быть отделены путем фильтрования. При этом большая часть веществ-эндометаболитов переходит в культуральную жидкость или раствор экстрагента.

Дальнейшее выделение и очистка целевых продуктов из культуральной жидкости или экстрактов зависит от их химической и физической природы.

Для извлечения таких соединений, как спирты, карбонильные соединения, кислоты, их производные, большинство антибиотиков, витаминов, алкалоидов, применяют обычные приемы и методы, используемые в химической технологии (перегонку, выпаривание, экстракцию, перекристаллизацию, возгонку и др.). В качестве примера приведем технологию экстракционного выделения бензилпенициллина из культуральной жидкости.

Современное производство бензилпенициллина включает в себя стадию глубинного культивирования микроорганизма-продуцента с последующим извлечением целевого продукта из культуральной жидкости.

На первом этапе мицелий отфильтровывается от культуральной жидкости (обычно на барабанных вакуум-фильтрах непрерывного действия). Фильтрат культуральной жидкости (нативный раствор) затем подвергается предварительной обработке (дополнительная фильтрация с применением активированного угля).

Выделение пенициллина из нативного раствора основано на способности пенициллина в виде кислоты растворяться в бутилацетате, в воде он нерастворим. Калиевая соль пенициллина, напротив, хорошо растворима в воде и нерастворима в бутилацетате. В производстве после передачи нативного раствора цеху химической очистки в сборник нативного раствора перед началом экстракции добавляют 0.03-0.06 масс.% дезэмульгатора (авироль) для лучшего разделения эмульсии.

Нативный раствор из сборника подают в эмульгатор, куда одновременно подается 9-12% раствор H2SO4 и охлажденный бутилацетат. В эмульгаторе происходит смешивание всех трех компонентов и экстрагирование бензил-пенициллина (кислоты) бутилацетатом. Температуру процесса поддерживают в пределах 10-120С, рН среды – 2,8 ± 3,0. При таком значении рН резко уменьшается степень диссоциации карбоксильных групп молекул бензилпенициллина, в недиссоциированном состоянии они переходят в органическую фазу (бутилацетат).Более сильные кислоты и другие электролиты находятся в диссоциированном состоянии и поэтому не растворяются в бутилацетате; в водной фазе остаются почти все минеральные компоненты, аминокислоты, водорастворимые белки. Затем эмульсия поступает в экстрактор, где дополнительно обрабатывается бутилацетатом.

Далее бутилацетатный экстракт последовательно отмывают обессоленной водой и подвергают двухступенчатой экстракции водным раствором бикарбоната натрия при рН = 7,3 -7,8. При этих условиях пенициллин находится в диссоциированном состоянии и хорошо растворяется в водной фазе и практически не растворим в бутилацетате. На данной стадии удается, очистится от примесей (в основном органических), являющихся более слабыми кислотами, чем бензилпенициллин.

Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстрагируют бутилацетатом при рН = 2,2 – 2,5.

Полученный вторичный бутилацетатный экстракт осветляют обработкой с активированным углем, далее вымораживают при -5*С в течение 20-30 минут, отфильтровывают от кусочков льда и кристалликов сульфата натрия, обезвоживая, таким образом, бутилацетатный экстракт.

Выделение калиевой соли бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта проводят путем добавления рассчитанного количества насыщенного раствора ацетата калия (раствор ацетата калия готовят в отдельном аппарате).

Полученную калиевую соль дополнительно очищают перекристаллизацией из водно-бутанольного раствора, полученные кристаллы отфильтровывают, промывают безводным бутанолом и сушат.

Наибольшую сложность представляет выделение продуктов белковой природы: ферментных препаратов, белковых антител, вакцин, гормонов и других физиологически активных веществ. Поэтому рассмотрим подробнее особенности их выделения и очистки на примере получения ферментных препаратов.

Проведение этих стадий процесса обусловлено рядом технических сложно-стей, связанных, в основном, с нестабильностью (лабильностью) ферментов, потерей им активности под влиянием незначительных изменений внешних условий. Поэтому при выборе технологии выделения, концентрирования и очистки ферментных препаратов ищут решения, позволяющие проводить эти процессы в непрерывном режиме, с высокой скоростью, в "мягких" услови-ях и добиваться максимального обезвоживания образующихся осадков. Для уменьшения потерь продуктов применяют различные стабилизаторы ферментов, проводят процесс при оптимальном значении рН растворов, стараются обеспечить максимально возможную механизацию и автоматизацию всех процессов.

Для предварительного концентрирования растворов ферментов перед их осаждением и сушкой используют процесс вакуум-упаривания. Его стараются проводить при нейтральных значениях рН раствора. При значениях рН раствора меньше 4,5 и больше 8,2 активность ферментов начинает падать уже при нагревании раствора выше 35*С. При рН = 6 тот же эффект наблюдается лишь при температуре выше 50*С. Установлено, что чем меньше время выпаривания, тем выше может быть температура греющего агента, а выпаривание наиболее очищенного раствора ферментов сопровождается большей потерей активности фермента. Последнее объясняется тем, что присутствующие в растворе примеси "защищают" выделяемый фермент от неблагоприятных температурных воздействий.

Процесс выпаривания чаще всего проводят в пленочных или роторных выпарных аппаратах. Потеря активности фермента в таком процессе может достигать 5-20%. С целью возможного снижения этой величины к выпа-риваемому раствору добавляют белки-стабилизаторы: альбумин, казеин или осуществляют выпаривание вместе с клетками продуцента. В качестве стабилизаторов используют и такие соли, как хлориды кальция, натрия и ацетат кальция. Правильный в качественном и количественном отношении подбор стабилизаторов позволяет при минимально допустимых потерях активности ферментов увеличить скорость процесса выпаривания раствора за счет повышения температуры греющего пара.

Технически более сложно осуществить процесс вакуум-упаривания непо-средственно культуральных жидкостей. По сравнению с водными экстрак-тами содержание сухих веществ в них в 4-5 раз ниже и составляет 2,5-3,5%. В ходе концентрирования раствора в осадок выпадают гидроксиды, сульфаты, карбонаты и фосфаты кальция, магния и других металлов. Это приводит к изменению солевого состава и рН раствора, что способствует инактивации фермента.

Часто полученный в процессе упаривания культуральной жидкости концентрат ферментов отделяют от осадка и, не подвергая дальнейшей очистке, добавляют к нему раствор хлорида натрия, чтобы довести концентрацию препарата в нем до 50% и предотвратить инфицирование продукта посторонней микрофлорой. Полученный таким образом препарат марки Г2х разливают по емкостям в 40-50 мл и отправляют потребителю.

В отличие от вакуум-выпаривания и других методов концентрирования ультрафильтрация или обратный осмос (фильтрование через фильтры со сверхмалым размером пор) имеет ряд очевидных преимуществ, поскольку проводится в "мягких" условиях, обеспечивающих меньший процент снижения активности фермента. Кроме того, осуществляемое концентрирование сопровождается очисткой от балластных низкомолекулярных примесей и увеличением активности фермента в 100-150 раз. Однако энергозатраты оказываются рентабельными при концентрировании раствора до содержания сухих веществ не более 30%,что связано с забиванием пор мембраны белковыми молекулами и как следствие резким снижением скорости процесса.

Процесс ультрафильтрации в режиме диализа позволяет получать высокоочищенные препараты. Для его осуществления в получаемый кон-центрат постоянно добавляют чистую воду. Такая пятикратная промывка позволяет в 250-300 раз повысить активность ферментного раствора, т.е. при концентрации 30% раствор содержит практически один белковый фер-ментный препарат.

На практике процесс ультрафильтрации проводят в циркуляционных аппаратах периодического действия. Перед подачей раствора на стадию ультрафильтрации из него предварительно удаляют клетки продуцента и для предотвращения развития посторонней микрофлоры на поверхности мембран подвергают стерилизующей фильтрации через специальные бактериальные фильтры. В ходе проведения процесса ультрафильтрации в зависимости от свойств получаемого фермента раствор постоянно охлаждается до температуры 4-15* С.

Недостатком метода ультрафильтрации следует считать забивание пор мембраны осадками или адсорбированными молекулами, что приводит к снижению производительности мембранного аппарата во времени. Последнее требует периодического проведения промывки материала мембраны. Для предотвращения забивания пор мембраны осадками или сорбирующимися молекулами циркуляционный насос, используемый в этих установках, должен обеспечить линейную скорость потока жидкости через мембрану около 2-5 м/с. При таких скоростях наблюдается значительное гидравлическое сопротивление. Для его снижения на практике применяют две конструкции мембранных аппаратов: трубчатые мембранные аппараты и проточные с плоскими мембранными элементами, устанавливаемыми парал-лельно основному потоку раствора.

Для концентрирования и выделения ферментных препаратов часто приме-няют процесс высаливания. Он основан на уменьшении растворимости большинства белков в солевых растворах. Для этой цели в технологии чаще всего используют сульфат аммония как наиболее дешевый и хорошо растворимый реагент. Однако недостатком использования сульфата аммония является выделение аммиака при повышенных значениях рН раствора, что приводит к коррозии металлических частей оборудования.

Тот же эффект высаливания достигается при использовании сульфата натрия вместо сульфата аммония. Однако из-за меньшей по сравнению с сульфатом аммония растворимостью его можно использовать при темпера-турах раствора не ниже 35-40*С. При охлаждении раствора наблюдается выпадение осадка сульфата натрия, что создает возможность его регенерации и повторного использования. Однако использование сульфата натрия предполагает повышение энергозатрат на нагревание растворов, а пребывание ферментов в условиях повышенных температур способствует их инактивации.

При проведении процесса высаливания большое значение имеет режим осуществления контакта соли с раствором фермента. Для высаливания можно брать соль в виде тонкоизмельченного порошка или в виде насыщенного раствора. В последнем случае процесс можно проводить в периодическом или непрерывном режиме. Установлено, что наибольший эффект - минимально необходимое количество соли на 1 кг осаждаемого белка - достигается при использовании соли в виде тонко измельченного порошка. Наименьший эффект достигается при непрерывном смешении насыщенного раствора соли с раствором фермента. Для достижения того же процента высаливания в последнем случае соли требуется в 1,3-1,5 раза больше.

Время образования осадков белков при высаливании для различных фер-ментов колеблется в пределах 0,5-12 часов. Время высаливания и необ-ходимое для проведения процесса количество соли зависят от количества (процентного содержания) растворенных веществ. Чем их больше, тем меньшее количество воды подлежит связыванию. Так, например, для полу-чения 1 кг препарата из культуральной жидкости требуется 45-50 кг соли, а из упаренного до 30%-ной концентрации раствора - только 1,4-1,6 кг.

В получаемых таким образом осадках белка содержится 60-85% балластных веществ, в том числе 30-45% соли. Повторное использование операций растворение - высаждение дает возможность получать высоко-очищенные ферментные препараты для медицинских целей.

Варьируя такие параметры, как температура и рН среды, в ряде случаев, возможно, осуществить фракционное высаждение белков. Для этого в присутствии соли изменяют рН исходного раствора или температуру, добиваясь денатурации балластной фракции белка. Последние необратимо выпадают в осадок, который отделяют от маточного раствора. На последующей стадии уже выделяют целевой ферментный препарат.

Довольно часто вместо соли используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000. Он оказывает стабилизирующее воздействие на активные белки, легко отделяется от белка методом ионообменной хрома-тографии или ультрафильтрации.

В технологии выделения ферментов методом осаждения значительное место занимает процесс получения активных белков осаждением их с помощью органического растворителя. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической постоянной среды, которая определяет величину силы электростатического взаимодействия между молекулами растворенного белка и растворителя. Устойчивость белковых растворов обусловлена толщиной гидратного слоя, окружающего молекулу белка. При разрушении этого гидратного слоя молекулы белка начнут образовывать конгломераты и выпадать в осадок. Для осуществления такого процесса необходимо использовать вещества более гидрофильные, чем осаждаемый белок. В качестве растворителей используют, в основном, этанол, метанол, изопропанол и ацетон. Варьируя тип органического растворителя, его количество, величину рН раствора можно проводить избирательное осаждение той или иной фракции белков.

В технологии процесс осаждения органическим растворителем проводят в реакторе непрерывного и периодического действия. Для снижения процента потерь активности выделяемого фермента при смешении растворителя с водным раствором активных белков обе жидкости первоначально охлаждают до температур соответственно -5 * -8* С и 5 * 6* С. Полученную смесь, содержащую не менее 8-10% белков, тщательно перемешивают, и через 20-30 мин происходит выпадение мелких частиц белка. Процесс осаждения проводят в вертикальном цилиндрическом аппарате с коническим днищем, снабженным мешалкой и рядом штуцеров для удаления жидкой фазы. Потеря активности фермента на этой стадии составляет около 15%, в основном, по причине длительного контакта фермента с органическим растворителем. Организация процесса по способу непрерывного осаждения при времени контакта 10-15 мин позволяет снизить потери активности фермента на 20-25%.

Полученный на этой стадии осадок отделяют на центрифуге, промывают чистым этанолом и вновь сепарируют до остаточной влажности 30-35%.

Для получения высокоочищенных ферментных препаратов, полученные на стадии выделения активные белки подвергают, как правило, сорбционной чистке. Поскольку в молекуле фермента присутствуют функциональные группы, сообщающие ей кислотный или основной характер, то обычно для этой цели используют метод ионного обмена на ионитах, полученных на основе целлюлозы: катионит КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и анионит ДЭАЭ (диэтиламиноэтилцеллюлоза).

В последние годы число различных ионитов сильно возросло, и для конкретного производства ферментного препарата существует возможность выбрать наилучший. Среди ионитов, получивших достаточно широкое распространение, необходимо отметить такие, как обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, катиониты на основе полиметакриловой кислоты, аниониты на основе поливинилового спирта и др.

Процесс проводят в насадочных колоннах, через которые пропускается раствор фермента, или в аппаратах с мешалкой. В последнем случае предпо-лагается последующее отделение твердой фазы.

Десорбцию осуществляют элюирующими растворами, специально подобранными для каждого фермента и сорбента.

Потери фермента на стадии сорбционной чистки не превышают 15%. Для получения более высокоочищенных ферментов используют различные препаративные методы. Среди них наибольшее распространение получили такие, как диализ, гельфильтрация, вымораживание, электрофорез, аффинная хроматография и др.

Диализ - процесс диффузии ионов через полимерную мембрану под действием градиента концентраций. При этом за счет диффузии через мембрану удаляются соли и другие низкомолекулярные продукты, а их место в исходном растворе ферментного препарата занимают молекулы растворителя, в данном случае воды. И хотя исходный раствор фермента при этом увеличивается в объеме, но активность его возрастает в 3-4 раза.

В последние годы с развитием промышленности по производству синте-тических пленок сильно возрос интерес к использованию процесса диализа в промышленном масштабе и был создан для его осуществления ряд про-мышленных установок.

Разновидностью процесса диализа является электродиализ. Перенос ионов через мембраны осуществляется в этом случае не за счет градиента концентраций, а под действием электрического поля.

Гельфильтрация - хроматографический метод разделения, основанный на использовании высокопористых носителей со строго определенным размером пор. При этом молекулы, способные проникнуть в поры носителя, дольше задерживаются в его материале, так как проходят при этом больший путь. В качестве материалов для проведения процессов гельфильтрации используют декстраны с поперечными связями, полиакриламид, стекло и др.

Вымораживание - метод основан на частичном замораживании раствора ферментного препарата. Образующиеся при этом кристаллы льда отделяют на центрифуге. Фермент концентрируется в водной фазе. Подбирая условия замораживания исходного раствора можно фракционировать белки по составу и еще более сконцентрировать целевой фермент.

Электрофорез - метод, основанный на различной подвижности ионов в электрическом поле. Процесс достаточно длительный. За счет диффузии может происходить размытие концентрационных зон. Частичная интенсифика-ция процесса возможна за счет создания температурного градиента. Применяется, в основном, для получения высокоочищенных препаратов в лабораторных условиях.

Аффинная хроматография – метод, основанный на способности ферментов избирательно связывать те или иные лиганды - субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной фермент из множества других белков.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители).

14. Существует 2 основных системы культивирования клеток.

1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).

Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток:монослойные культуры и суспензионные культуры.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:

1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.

2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.

3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.

4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.

5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Недостатками монослойных культур являются:

требования большого пространства;

возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;

сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.

Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления (рис. 27):

системы культивирования животных клеток

1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.