Методы-выделения микроорганизмов-деструкторов

Рассмотрим методы выделения микрооганизмов-деструкторов на примере бактерий, приводящих к порче пищевых продуктов.

1.3.2.1 Выделение Pseudomonas

Для выделения псевдомад широко используется метод агаровых сред. К селективным веществам, обычно использующимся для ингибирования роста непсевдомонадной микробиоты, относятся цетримид, красители (фуксин, кристаллический фиолетовый или фуцидин) и антибиотики (эритромицин, хлорамфеникол, налидиксовая кислота, циклогексимид, новобиоцин или пенициллин). Эти антимикробные препараты обычно добавляют в концентрации, достаточной для подавления роста непсевдомонадной микробиоты. В качестве диагностических сред для обнаружения штаммов, проду­цирующих флуоресцентный пигмент флуоресцеин (в частности, P. fluorescens), или штаммов, продуцирующих нефлуоресцентный пигмент пиоцианин (в частности, P. aeruginosa), как правило, используют среды Кинга В и А, кото­рые промышленно выпускаются под названием Difco (Pseudomonas agar F и P). Для улучшения обнаружения P. fluorescens, P. aeruginosa и других псевдомонад в воде, почве, пищевых продуктах и клинических образцах в указанные среды Кинга и дру­гие базальные среды для обнаружения Pseudomonas (Oxoid) можно добавлять це­тримид или налидиксовую кислоту.

Агар CFC, содержащий цетримид, фуцидин и цефалоридин, представляет собой селективную среду, обычно используемую для выделения психротрофных псевдомонад из молока, мяса, рыбы и птицы. Он предотвращает рост подавляющего большинства представителей непсевдомонадной микробиоты, включая Enterobacteriaceae и грамположительные виды Bacillus и Lac­tobacillus, и оказывает минимальное влияние на размножение вызывающих порчу псевдомонад, включая P. fluorescens, P.fragi, P. lundensis, P. aerugionos и P. putida.

Применение для выделения псевдомонад селективных агаровых сред – широко используемый способ оценки санитарно-гигиенического состояния пищевого тех­нологического оборудования и микробиологического качества пищевых продуктов.

Тем не менее не следует недооценивать недостатки этого метода, в том числе не­достаточную избирательность этих сред и невозможность восстановления жизне­способных, но непригодных к культивированию (VBNC)или сублетально повреж­денных псевдомонад.

1.3.2.2 Выделение Xanthomonas

Представители рода Xanthomonas, способные вызвать порчу овощей и фруктов, мо­гут расти на пектатных агаровых средах, которые обычно используют­ся для выделения вызывающих мягкую гниль Pseudomonas и Erwinia. Тем не менее штаммы ксантомонад легко отличить от псевдомонад по их способности продуци­ровать окрашенный желтым пигментом ксантомонадин и слизеподобную ксантамовую смолу. Подобно другим ксантомонадам, Xanthomonas, вызывающие мягкую гниль, не способны размножаться в культуральной среде без органических добавок. Ксантомонады чувствительны к антимикробным препаратам, добавляемым в псевдомонадные селективные агары (например, к тетразолия трифенилхлориду и др.). Для выделения фитопатогенных Xanthomonas зачастую применяют ряд антимикробных препаратов, в частности циклогексимид-метиловый зеленый и ванкомицин. Кроме того, для выделения специфических видов или патогенных вариантов Xanthomonas выпускается ряд селективных агаровых сред, однако неизвестно, пригодны ли эти агары для выделения штаммов ксантомонад, вызыва­ющих мягкую гниль.

1.3.2.3 Выделение Shewanella

Представители рода Shewanella (семейства Vibrionaceae) широко распространены в природе и выделяются из свежих и испорченных пищевых продуктов, отходов пе­реработки нефти, холодной воды, из морских глубоководных отложений и клини­ческих образцов. Установлено, что типовой вид этого рода, S. putrefaciens, вызывает порчу многих пищевых продуктов, включая мясные, молочные и рыбные, а также продукты из мяса птицы. При культивировании на тиосульфате или полисульфи­де S. putrefaciens продуцируют сероводород (H₂S). Эта бактерия также может утилизировать нитрат серы и оксид железа в качестве акцепторов электронов для дыхательного роста. Тем не менее, S. putrefaciens не способны использовать для сво­его размножения гликолиз или брожение, а также утилизировать лактат, пируват, формиат и аминокислоты в качестве источников углерода, и эти особенности мета­болизма могут служить диагностическими признаками для обнаружения S. putre­faciens. Кроме того, продуцирование H₂S является важным признаком для обнару­жения на рыбе сульфидпродуцирующих бактерий. Степень продуцирования сероводорода при хранении охлажденной рыбы может использоваться в качестве по­казателя роста S. putrefaciens и для прогнозирования срока ее годности.

1.3.2.4 Выделение пектолитических и протеолитических бактерий

Пектолитические штаммы P. fluorescens и P. viridiflava считаются основной причи­ной порчи свежих продуктов, хранящихся в присутствии воздуха и при ходильных температурах. Наиболее распространенной пектатной средой, разработанной для выделения пектолитических микроорганизмов, является среда СУР (кристаллический фиолетовый + пектат). Для выде­ления пектолитических псевдомонад из почвы или ризосфер также используется среда Pseudomonas CFC, дополненная пектатом. Для выделения протеоли­тических псевдомонад, вызывающих болезни растений и порчу пищевых про­дуктов, применяют базальную среду для псевдомонад, дополненную селективными антимикробными препаратами и желатином (или обезжиренным молоком).

1.3.2.5 Выделение спорообразующих бактерий

Для выделения термофильных бактерий используют культивирование при 50–55 °С в течение 2–3 сут на декстрозо-триптоновом агаре после более жесткой тепловой обработки (например, при 100 °С в течение 5 мин). Для G. stearothemophilus стандартной процедурой является 30-минутное нагрева­ние при 100 °С (или 10–минутное при 110 °С) с последующим быстрым охлажде­нием. Для выделения спорообразующих бактерий, вызывающие картофель­ную болезнь хлеба, в вышеупомянутых неселективных агарах могут использоваться соли тетразолия.

После этого для идентификации изолятов можно использовать различные мето­ды, включая молекулярные и более традиционные, основанные на биохимических или фенотипических свойствах.

Для выделения Alicyclobacillus spp., единственных спорообразующих бактерий, способных портить сильнокислые продукты, применяют методы, основанные на ис­пользовании культуральных сред или фильтрации. Эти микроорганизмы не способ­ны расти на стандартных агаровых средах (питательном агаре, сердечно-мозговой вытяжке, триптиказо-соевом агаре), даже если они подкислены до более низких значений рН. Как и в других методах выделения спорообразующих бактерий, здесь также присутствует начальный этап нагревания, в ходе которого образец выдержи­вают при температуре 80 °С в течение 1–10 мин. Обычно применяют следующие культуральные среды: среда Alicyclobacillus acidocaldarius (ААМ) или среда Bacillus acidocaldarius (ВАМ;, агар с апельсиновым соком (OSA, orange serum agar), дополненный сахарозой; картофельный агар с декстрозой (PDA, potato dextrose agar), обычно используемый для культивирова­ния дрожжей и плесеней, ацилированный до рН 3,5; дрожжевой крахмало-глюкозный агар (YSG, yeast-starch-glucose), ацилированный до рН 3,7; сре­да HGYE; а также iC-arap. Из фильтрационных методов обычно используют фильтрацию через фильтр с раз­мером пор 0,45 мм. Этот способ улучшает восстановление по сравнению чашечными методами и в настоящее время его широко применяют при переработке фруктов.

Выделение анаэробных спорообразующих бактерий зачастую затрудняется жест­кими требованиями к споруляции некоторых из этих видов, и многие из них оста­ются необнаруженными, если не используются правильные условия восстановле­ния/выделения. По этой причине бывает необходимо использовать селективно- диагностические среды. На начальном этапе выделения используется бульон из среды для Clostridium (RCM ), дифференциальная улучшенная среда для выявле­ния клостридий (DRCM ), среда, продуцирующая H₂S или среда на мясном бульоне.

Многие клостридии в содержащих железо средах при анаэробных условиях восстанавливают сульфит до сульфида и образуют черные колонии. Рост Enterobacteri асеае можно подавить путем включения полимиксина, а восстанавливающие суль­фит Bacillus spp. можно распознать по чувствительности к метронидазолу. Возмож­ность использования газ-пакетов и мешков, непроницаемых для кислорода, значи­тельно облегчает культивирование анаэробов в последние годы.

Масляные анаэробы можно выделить путем выдерживания продукта при темпе­ратуре 76,6 °С в течение 10 мин и использования агара для термо- и кислотостойких микроорганизмов, покрытого слоем тиогликолатового агара. Рост, сопрово­ждаемый газообразованием, свидетельствует о присутствии масляных анаэробов. Среды, исполь­зуемые для выделения анаэробов, можно сделать более специфическими для С. tyrobutyricum путем замены глюкозы лактатом и доведения значения рН до 5,3–5,5.

Для выделения D. nigrificans разработаны различные среды. Среди них можно отметить агар BETI (Beef Extract Tryptone Iron, мясной экстракт–триптон–железо), бульон Baars и соя-метабисульфит натрия-железистый цитрат аммония.

Для выделения термофильных анаэробов, не продуцирующих сероводород, на­пример Т. thermosaccharolyticum, рекомендуется использовать среду РЕ- 2. В этих целях используется также печеночный бульон, хотя он труднее в приготовлении и может ингибировать восстановление микроорганизмов, чувстви­тельных к антибиотикам [12].