Пэтч-кламп метод

Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума²-³*. Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp⁴- ⁵>). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то:

какой заряд проходит через одиночный канал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакманном и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки (рис. 2.3А—В) создается сопротивление больше 10⁹ Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходящие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки (рис. 2.3F). Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой). Высо-коомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через

Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация

(А)

■Electrode tip

Cell

(Cigaohra seal) CELL ATTACHED

\)-|/f^D)'

Рис. 2.3. Регистрация ионных токов методом пэтч-кламп. Электрод образует плотный контакт с мембраной (А), который благодаря легкому понижению давления превращается в гигаомный контакт (В). Оттягивание мембраны с последующим отрывом ее фрагмента приводит к конфигурации inside-out (С). Другой вариант основан на последовательном образовании конфигурации whole celt и затем — outside-out (E).

Fig. 2.3. Patch Clamp Recording. (A-E) Patch configurations, represented schematically. The electrode forms a seal on contact with the cell membrane (A), which is converted to a gi-gaohm seal by gentle suction (B) Records may then be made from the patch of membrane within the electrode tip (cell-attached patch). Pulling away from the cell results in the formation of a cell-free vesicle, whose outer membrane can then be ruptured to form an inside-out patch (C). Alternatively, the membrane within the electrode tip may be ruptured by further suction to obtain a whole-cell recording (D) or, by pulling, to obtain an outside-out patch (E). (F) Recording arrangement. The patch electrode is connected to an amplifier that converts channel currents to voltage signals. The signals are then displayed on an oscilloscope trace or computer screen so that amplitudes and durations of single-channel currents can be measured. (A-E after Hamill et aL, 1981.)

Pull (low Ca²⁺)

(C) INSIDE-OUT PATCH

|/(D) WHOLE-CELL f \ RECORDING