Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами*(15) серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:
а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).
б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;
в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;
г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.
2. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)
с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами
Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, причем, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".
Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.
Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.
2.1. Необходимые реагенты и приборы:
- эритроцитарные менингококковые серогруппы А, В и С диагностикумы;
- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические А, В и С *(16);
- нормальная кроличья сыворотка*(17), сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин*(18);
- исследуемый материал (сыворотка крови человека);
- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");
- термостат для поддержания температуры 37°С;
- водяная баня для поддержания температуры 56°С;
- потенциометр для измерения рН растворов;
- пипетки стеклянные мерные (ГОСТ 20-292-74);
- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05 (2Т2.933.053 ТО);
- хлорид натрия (NaCl),
- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Nа2НРО4-12H2O);
- калий фосфорно-кислый однозамещенный (КН2Р04);
- дистиллированная вода.
2.2. Подготовка ингредиентов.
2.2.1. Приготовление исходного забуференного физиологического раствора рН 7,2 (ЗФР).
В 0,5 л дистиллированной воды растворяют:
хлорида натрия (NaCl) - 8,65 г
натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HPO4х2Н2О) - 1,92 г
калия фосфорно-кислого
однозамещенного (КН2РО4) - 0,44 г
Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой.
После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7.2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.
ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.
2.2.2. Стабилизирующий буфер.
В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).
Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56°С в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.
2.2.3. Взятие крови.
Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики: при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.
После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4°С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.
Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.