Определение активности лактопероксидазы

а ) Метод Б.П. Плешкова.

Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии лактопероксидазы с обра­зованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Подготовка к анализу:

1) Приготовление 2,5 мМ раствора бензидина.

184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллирован­ной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного раство­рения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нем 5,45 г трех­водного уксуснокислого натрия и доводят общий объем раствора дистиллированной водой до 400 мл.

2) Приготовление 0,333н перекиси водорода.

К 0,6 мл перекиси водорода добавляют 99,4 мл дистиллирован­ной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раст­вором перманганата калия (НКМn0₄). На титрование 3,0 мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0 мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода дово­дят до нужной концентрации дистиллированной водой.

3) Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко наг­ревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Оборудование и аппаратура:

1) Спектрофотометр с термостатируемой кюветой.

2) Секундомер.

3) Ультратермостат.

4) Бюретка для титрования.

5) Пробирки химические.

6) Весы аналитические.

Проведение анализа:

В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10мм наливает 2,0 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содержимое кюветы перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны 520 нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60 с (по секундомеру) определяют оптическую плот­ность.

Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плот­ности контрольной пробы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1 мл дистиллированной воды.

Обработка результатов:

Активность лактопероксидазы рассчитывают по формуле и выра­жают в условных единицах активности (УЕА).

(Ео-Ек) х 10

УЕА = -------------------------------,

где УЕА - активность фермента, Ед ОП/мл;

Ео - оптическая плотность опытной пробы;

Ек - оптическая плотность контрольной пробы;

10 - коэффициент пересчета в 1 мл;

60 - время проведения реакции, с.;

УЕА - изменение оптической плотности на 0,01 за 1 с одним мл сыворотки молока.

б ) Модифицированный метод Орам и Рейтер.

Подготовка к анализу:

1) Приготовление 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,7. 6,8 г двузамещенного фосфорнокислого калия (КН₂РО₄) раство­ряют в 500 мл дистиллированной воды и 11,4 г водного однозамещенного фосфорнокислого калия (КН₂РО₄ х 3Н₂О) растворяют в 500 мл дис­тиллированной воды. В раствор двузамещенного фосфорнокислого ка­лия под контролем рН-метра приливают раствор однозамещенного фос­форнокислого калия до установления рН 6,7.

2) Приготовление 0,01% раствора ортодианизидина. 10 мг орто-дианизидина растворяют в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,7.

3) Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и моло­ко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, асыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа:

К 3 мл 0,01% раствора орто-дианизидина добавляют 0,1 мл исс­ледуемой сыворотки молока, тщательно перемешивают и определяют экстинцию на спектрофотометре при длине волны 460 нм с рабочей длиной кюветы 10мм. Затем в кювету доливают 0,1 мл 9 мМ перекиси водорода, хорошо перемешивают и выдерживают в водяной бане или термостате при температуре 37°С 5 мин. Снова измеряют экстинцию при той же длине волны.

Обработка результатов:

Активность лактопероксидазы выражают в условных единицах ак­тивности (УЕА) и определяют по формуле:

До – Д₅

УЕА = ————————,

где - До - начальная экстинция молока;

Д₅ - экстинция через 5 мин;

5 - время инкубации образца при температуре 37°С, мин.

УЕА - изменение экстинции на 0,001 единицы за 1мин одним мл сыворотки молока.

в молоке клинически здо­ровых коров в середине лактации активность лактопероксидазы сос­тавляет 535,0±44,0 УЕ, а у больных субклиническим маститом 964,0±32,0 УЕ