Важное значение при разработке методики хроматографического исследования имеет выбор элюентов и условий хроматографирования. При выборе элюентов учитывали характер анализируемых соединений и их способность растворяться в амфифильных растворителях.
Было исследовано влияние подвижных фаз различного состава на селективность методики. Выбор состава подвижных фаз был основан на кислотно-основных свойствах метронидазола. Метронидазол является амфолитом, так как содержит в молекуле одновременно кислотный и основный центр [11].
Нормативные документы на лекарственные формы метронидазола рекомендуют использовать в качестве компонента подвижной фазы метанол, обладающий высоким токсичным эффектом и требующий специальных условий хранения. Для оптимизации методик нами был проведен опыт с применением более безопасного и доступного растворителя – ацетонитрила[12,13].
Ацетонитрил широко применяется в анализе фармацевтических препаратов, а также обладает высокой элюирующей силой, низкой вязкостью, доступностью, сравнительно низким токсическим действием. Вторым элюентом был выбран раствор дигидрофосфата калия, который является наиболее распространенным элюентом в ВЭЖХ-анализе, т.к. позволяет задать необходимое значение рН [19-21].
В ходе эксперимента было установлено, что при использовании смеси раствор 0,1 М дигидрофосфата калия рН 6,4 и ацетонитрила (85:15) время удерживания метронидазола составляет 5,7 минут. Данный показатель времени удерживания был получен в результате экспериментов путем изменения соотношения объема растворителей, при определении специфичности методики.
Валидация методики. Валидацию методики определения метронидазола проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA и EMA, а также «Руководства по экспертизе лекарственных средств» [18].
Согласно современным рекомендациям ICH и ведущих фармакопей методика количественного определения должна быть валидирована по основным характеристикам, таким как специфичность (specificity), линейность (linearity), правильность, или истинность (accuracy, or trueness), прецизионность (precision).
Специфичность методики. При подборе условий разделения метронидазола в присутствии компонентов ЛП и примесей удалось достичь полного разделения. На хроматограмме пики определяемых веществ хорошо разделены между собой, пики примесей из растворителя, компоненты подвижной фазы и основы лекарственной формы не мешают их определению.
Для определения специфичности проводили анализ 5 образцов стандартного раствора метронидазола в диапазоне концентраций 56,0-84,0 мкг/мл. На хроматограммах стандартных образцов не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания метронидазола. Соответствующие хроматограммы приведены на рисунках 1 и 2.
Рисунок 1 -Хроматограмма стандартного раствора метронидазола
(конц. 56 мкг/мл)
Рисунок 2 - Хроматограмма стандартного раствора метронидазола
(конц. 84 мкг/мл)
Линейность. Проводили анализ 7 стандартных растворов следующих концентраций: 56 мкг/мл, 59,5 мкг/мл, 63 мкг/ мл, 70 мкг/мл, 77 мкг/мл, 80,5 мкг/мл, 84 мкг/мл. По полученным значениям построены калибровочные график (r2 = 0.99952), приведенный на рис. 3 совместно с уравнением калибровочной кривой.
Рисунок 3 - Калибровочный график зависимости площади пика метронидазола от его концентраций.
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости от фактических значений приведены в таблицах 2, 3.
Таблица 2 -Калибровочная последовательность №1
Код пробы | std (mkg/ml) 56 | std (mkg/ml) 59,5 | std (mkg/ml) 64 | std (mkg/ml) 70 | std (mkg/ml) 77 | std (mkg/ml) 80,5 | std (mkg/ml) 84 |
C факт, мкг/мл | 59,5 | 80,5 | |||||
С рассчит, мкг/мл | 56,81 | 59,2 | 64,07 | 70,43 | 76,56 | 79,01 | 84,31 |
ε, % | 1,5 | 0,5 | 0,1 | 0,6 | 0,6 | 1,8 | 0,4 |
Норма | Не более 2,00% |
Таблица 3 - Калибровочная последовательность №2
Код пробы | std (mkg/ml) 56 | std (mkg/ml) 59,5 | std (mkg/ml) 64 | std (mkg/ml) 70 | std (mkg/ml) 77 | std (mkg/ml) 80,5 | std (mkg/ml) 84 |
C факт, мкг/мл | 59,5 | 80,5 | |||||
С рассчит, мкг/мл | 56,93 | 59,08 | 64,08 | 70,5 | 76,52 | 78,96 | 84,34 |
ε, % | 1,7 | 0,7 | 0,1 | 0,7 | 0,6 | 1,9 | 0,4 |
Норма | Не более 2,00% |
Полученные отклонения соответствуют нормам FDA и EMA (не более 2% для всего диапазона линейности).
Правильность и прецизионность. Проводили анализ 3 образцов с прибавлением стандартного раствора метронидазола до получения концентраций: 56 мкг/мл, 70 мкг/мл, 84 мкг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Исследование проводили в течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter - day). Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε,%), приведенные в таблицах 4 и 5.
Таблица 4 - Правильность и прецизионность (сходимость) методики (intrer- run). Последовательность №1
Введено (мкг/мл) | Найдено (мкг/мл) | Найдено (мкг/мл), среднее значение (n=6) | S.D. (n=6) | RSD, % (n=6) | ε, % |
56,48 | 56,57 | 0,158 | 0,280 | 1,018 | |
56,88 | |||||
56,53 | |||||
56,57 | |||||
56,52 | |||||
56,44 | |||||
70,55 | 70,46 | 0,119 | 0,170 | 0,662 | |
70,63 | |||||
70,4 | |||||
70,5 | |||||
70,3 | |||||
70,4 | |||||
84,87 | 85,09 | 0,109 | 0,129 | 1,300 | |
85,14 | |||||
85,12 | |||||
85,15 | |||||
85,12 | |||||
85,15 |
Таблица 5 - Правильность и прецизионность методики (inter-run). Последовательность № 2
Введено (мкг/мл) | Найдено (мкг/мл) | Найдено (мкг/мл), среднее значение (n=12) | S.D. (n=12) | RSD, % (n=12) | ε, % (n=12) |
56,66 | 56,607 | 0.117 | 0.207 | 1.083 | |
56,62 | |||||
56,66 | |||||
56,71 | |||||
56,58 | |||||
56,63 | |||||
70,53 | 70,486 | 0,106 | 0,150 | 0,694 | |
70,34 | |||||
70,52 | |||||
70,59 | |||||
70,47 | |||||
70,6 | |||||
85,12 | 85,198 | 0,150 | 0,177 | 1,426 | |
85,33 | |||||
85,32 | |||||
85,37 | |||||
85,26 | |||||
85,42 |
Полученные величины относительного стандартного отклонения (прецизионность) и относительной погрешности (правильность) соответствуют нормам (не более 2,00 %).
Стабильность. Стабильность была подтверждена для стандартных растворов метронидазола (при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2 до 8 оС), кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 ч при анализе на следующий день) - на уровнях концентрации 56 мкг/мл 56 нг/мл и 84 мкг/мл концентрации. Площадь пика при повторных анализах не менялась более, чем на 10%.
Выводы. Разработана унифицированная методика хроматогра-фического анализа метронидазола в субстанции и лекарственных препаратах. Результаты валидации позволяют использовать разработанную методику в фармацевтической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Падейская Е.Н. Метронидазол – антимикробный препарат для лечения бактериальных и протозойных инфекций// РМж.-2010. - С 909-914
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 16-ое издание.-2012 г., т. II.-С.-322-324
3. Справочник Видаль 2013 г. Лекарственные препараты в России. Vidal 2013.-С.276-278
4. Белоусов Ю.Б., Шатунов С.М. Антибактериальная химиотерапия. / Ремедиум 2001.
5. Теплых А.Н., Илларионова Е.А. Количественное определение метронидазола спектрофотометрическим методом // Сибирский медицинский журнал.- 2009 № 5.-С.48-50
6. ГФ Республики Казахстан.- том II.- 2009.-С.541-544
7. ГФ Российской Федерации XII.- часть I –2007.-С. 346-347
8. U.S. Pharmacoрoiea. - 30,32 NF.- 2007.- Р. 377-380
9. British Pharmacoрoeiа.-V.- I.- 2009.-Р.301-303
10. Барам Г.И., Рейхарт Д.В.,.Гольдберг Е.Д,.Изотов Б.Н, Родинко М.О., Хазанов В.А. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2003.- т.135, №1, с.75-79
11. Беликов B.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч: Учебн. пособие - М.: МЕД пресс-информ,- 2008.-С. 429.
12. Лазарев Н. В., Левина Э. Н. Вредные вещества в промышленности // Справочник для химиков, инженеров и врачей. Изд. 7-е, пер. и доп. В трех томах. Том I. Органические вещества.2008.-С.-176-177
13. Armarego W. F., Chai C. L. L Purification of Laboratory Chemicals. — 6th Ed. — Elsevier, 2009. — С. 91—92. — ISBN 978-1-85617-567-8.
14. URL: http://cyberleninka.ru/article/n/razrabotka-detskoy-lekarstvennoy-formy-na-osnove-mikrokapsul-s-metronidazolom.
15. Mikrobiyol Bul, The First Metronidazole-Resistant Bacteroides Species Isolated at Marmara University Hospital: Bacteroides the taiotaomicron. - 2013 Oct.-Р.717-21
16. Metronidazole increases the emergence of ciprofloxacin- and amikacin-resistant Pseudomonas aeruginosa by inducing the SOS response/Journal of Antimicrobial Chemotherapy Volume 68 Issue 12 December 2013.-Р.72-75
17. Эпштейн Н. А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. -Т. 38. - № 4. - С. 40-55.