Клеточно-тканевой уровень

Особенности индукции облучением
хромосомных аберраций

В отличие от точковых мутаций индукция хромосомных аберраций не только эффективно изменяется под воздействием физических и химических модификаторов, но и зависит от многих факторов, зачастую не контролируемых экспериментатором. Рассмотрим основные из них.

Известно, что разные виды живых существ обладают различной радиочувствительностью. Известно также, что разные стадии и гаметогенеза, и клеточного цикла тоже обладают различной радиочувствительностью. Однако нельзя говорить о радиочувствительности вообще, так как общая радиочувствительность, определяемая по летальной или полулеталыюй дозе, не всегда коррелирует с цитогенетической радиочувствительностью разных органов, тканей и клеток, между которыми часто отсутствует корреляция по индукции хромосомных аберраций. При определении генетической радиочувствительности с помощью разных тестов можно получить противоположные результаты, так как разные стадии клеточного цикла и гаметогенеза, а также линии животных с разным генотипом и т. д. различаются по радиочувствительности, выявляемой по тесту хромосомных аберраций, но имеют одинаковую радиочувствительность по тесту точковых мутаций. Чтобы избежать получения противоречивых данных, надо учитывать специфику каждого используемого теста, а также разнообразные факторы, изменяющие или искажающие результаты оценки кластогенного действия ионизирующей радиации (равно, как и любых других мутагенов).

Генотип. Индукция облучением хромосомных перестроек существенно отличается у особей разных генотипов. Так, например, у гибридных мышей (С₃Н X 101) F₁ при облучении возникает более высокая частота врожденных аномалий и реципрокных транслокаций по сравнению с гибридами (SFC X С57ВL) F₁ [Rutledge J.C. и др., 1986г.]. Аналогичные данные получены и при исследовании других линий мышей [Bishop J.B. и др., 1981г.].

У мышей конгенных линий выявлены группы с высокой и низкой частотой возникновения хромосомных аберраций [Miyashita N. и др.,1987г.].

Межлинейные различия радиочувствительности ряд авторов связывает с неодинаковой эффективностью репарационных процессов у разных линий. В частности, различная степень восстановления ДНК в клетках млекопитающих разных линий оказалась ответственной за различия в их радиочувствительности [Miyashita N. и др.,1987г., Fujiwara Y., 1977г.].

Известно, что радиочувствительность клеток зависит от плоидности. Например, повышенная радиочувствительность мутанта дрожжей rad 51 обнаружена лишь у диплоидов, а аналогичный гаплоидный мутант обладает такой же устойчивостью к радиации, что и дрожжи дикого типа [Петин В.Г., 1978г.]. Такие же результаты получены японскими исследователями, при изучении мутанта дрожжей rad 52 [Hakau C. и др., 1978г.].

На цитогенетическую радиочувствительность клеток влияют даже небольшие изменения генотипа. Так, показано, что частота аберраций, индуцируемых в культивируемых фибробластах человека, значительно выше в клетках с трисомией хромосом по сравнению с диплоидными клетками [Waller H. и др., 1986г.], а частота транслокаций в клетках мышей с нормальным кариотипом оказалась выше, чем у мышей, гетерозиготных по транслокации [Buul P.P.W. van и др., 1980г.].

При этом межлинейные различия по цитогенетической радиочувствительности могут не коррелировать с общей радиочувствительностью. Так, мыши линии 101/Н оказались гораздо более чувствительными в отношении вызываемой рентгеновским излучением гибели сперматогониальных клеток, чем гибриды (СЗН/НеН X 101/Н)Р], но в то же время уровень транслокаций у мышей 101/Н оказался существенно ниже [Cattanach B.M. и др., 1978г.].

Тканевая специфичность. Сравнение радиочувствительности по тесту хромосомных перестроек затрудняется тем, что нет корреляции между различной частотой аберраций у разных линий и в клетках разных тканей животных, т. е. линия, более чувствительная к индукции перестроек в каких-то соматических клетках, оказывается устойчивой к индукции аберраций в половых клетках, и наоборот [Medle E. и др., 1986г.]. Так, в работе [Домарева О.П. и др., 1973г.] показано, что относительная радиочувствительность мышей четырех генотипов, определяемая по выходу хромосомных перестроек в сперматоцитах, обратна таковой в клетках роговицы глаза.

По данным работы [Buul P.P.W. van., 1973г.], при рентгенооблучении мышей в дозе 400 рад в костном мозге возникает в 4,2 раза больше аберраций, чем в сперматоцитах. Предполагалось, что причинами этого различия являются разные методы определения хромосомных перестроек в указанных тканях, а также неодинаковая элиминация и пролиферация клеток, несущих аберрации, в пострадиационный период. В ней указывалось на отсутствие корреляции между чувствительностью этих тканей по тесту хромосомных аберраций и по клеточной гибели, что приводит к выживанию клеток с перестройками в разных тканях [Buul P.P.W. van., 1973г]. Сравнительное изучение хромосомной радиочувствительности лимфоцитов крови и сперматогониальных клеток у мыши и макаки-резуса было продолжено в работе [Waller H. и др., 1986г.]. Полученные результаты позволили сделать вывод об отсутствии фиксированного соотношения между частотой индуцированных радиацией аберраций в соматических и половых клетках. Поэтому авторы считают, что при определении степени генетического риска воздействия облучения на человека решающую роль должна играть прямая оценка частоты мутаций в половых клетках [Waller H. и др., 1986г.].

Сравнение радиочувствительности лейкоцитов периферической крови и сперматогониальных клеток у мышей и китайского хомячка показало, что частота хромосомных обменов, индуцированных радиацией в половых клетках, ниже, чем в лейкоцитах [Brewen J.G. и др., 1973г.]. Обнаружено также [Домарева О.П. и др., 1973г.], что частота аберраций, вызываемая облучением в роговице глаза, больше, а в печени меньше, чем в половых клетках.

Кроме причин, обусловливающих разную индукцию аберраций в разных тканях организма, большую роль играют и различия в эффективности репарационных систем. Показано, например, что в клетках млекопитающих репарационные энзимы обладают неодинаковой активностью в тканях разных орга­нов [Margison S.P. и др., 1976г.].

Возраст и пол. Известно, что цитогенетическая радиочувствительность увеличивается по мере старения организма. Однако влияние возраста на индукцию мутаций не всегда однозначно. Так, уровень реципрокных транслокаций и фрагментов хромосом у мышей значительно возрастает с увеличением возраста от 75 до 850 дней, а частота гипергаплоидных и анеуплоидных клеток не изменяется [Pacchierotti F. и др., 1984г.].

У старых облученных самок мыши частота аберраций в 3 раза выше, чем у молодых. Интересно, что при этом играет роль репродуктивный статус самок – после облучения старых девственных самок они давали помет меньшего размера, чем повторнородящие самки того же возраста [Searle A.G. и др., 1985г.].

Возрастные различия в повреждаемости хромосом выявлены и для культивируемых клеток человека [Waller H. и др., 1986г, Виленчик М.М. и др., 1980г.], и для клеток печени плода мышей [Harper B.L. и др., 1987г.].

Увеличение частоты индуцированных мутаций при старении можно объяснить нарушением репарационных процессов. Эффективность систем восстановления весьма лабильна, она различна в клетках с разным уровнем метаболизма и может быть подвержена воздействию самых разнообразных факторов, с которыми соприкасается организм в течение жизни. Эффективность систем репарации изменяется с возрастом, а также имеет видовую, органную и тканевую специфичность [Lohman P.H.M.и др., 1987г.].

Хорошо известны и различия в работе репарационных систем у особей разного пола. Например, в сперматозоидах дрозофилы ферменты репарации отсутствуют, а повреждения, возникающие в этих клетках, репарируются после оплодотворения за счет репарационных ферментов самки. Однако различный выход структурных мутаций в клетках у особей разного пола может определяться и разной чувствительностью этих клеток к облучению [Guzman J.R. и др., 1987г., Battu K.B., 1984г.].

Специфика стадий клеточного цикла и гаметогенеза. Радиочувствительность разных стадий клеточного цикла по тесту хромосомных перестроек неодинакова [Okada S. и др., 1977г.], что обусловлено не различной чувствительностью самого генетического материала, а разной эффективностью репарационных процессов на этих стадиях.

Еще в 1975 г. Н. В. Лучник писал, что на всех стадиях цикла мишень имеет одну и ту же природу. Радиация вызывает одно и то же или примерно одно и то же число потенциальных повреждений, и природа этих повреждений также одна и та же. На всех стадиях клеточного цикла одинакова и возможность репарации [Luchnik N.V. и др., 1975г.].

Аналогичные выводы сделаны и в ряде других работ [Ганасси Е.Э., 1976г., Заичкина С.И. и др., 1981г.], в которых отмечается, что различия в выходе структурных повреждений хромосом обусловлены разным вкладом репарации [Ганасси Е.Э., 1976г.].

Однако, кроме различий в эффективности репарационных процессов, протекающих на разных стадиях клеточного цикла, на индукцию облучением хромосомных перестроек может влиять длительность протекания одной и той же стадии. Так, при сравнении радиочувствительности нейробластов двух линий кобылок, имеющих периоды клеточных циклов 2 и 4 ч, было показано, что значительно большее число фрагментов хромосом возникает в клетках с четырехчасовым циклом [Gaulden M.E. и др., 1984г.]. Авторы связывают это явление с тем, что при данной дозе облучения начальное индуцирование у клеток с четырехчасовым циклом больше, чем у клеток с двухчасовым циклом, хотя кривые митотического восстановления одинаковы у обеих линий.

Хорошо известна различная радиочувствительность по тесту хромосомных перестроек разных стадий гаметогенеза. Одной из причин этого явления служит большая степень селекции предмейотических клеток с нарушением хромосом по сравнению с постмейотическими [Померанцева М.Д., 1987г.]. Что же касается последних, то, безусловно, главную роль в изменении выхода структурных мутаций играют различия в эффективности репарационных процессов, протекающих в клетках разной степени зрелости. В экспериментах с четырьмя линиями дрозофилы, в том числе с нарушенными системами репарации ДНК, изучалась чувствительность разных стадий оогенеза к рентгеновскому излучению и экспериментально показано, что работа систем репарации ДНК стадиеспецифична [Тихомирова М.М., 1984г.].

Поскольку стадии клеточного цикла и гаметогенеза имеют неодинаковую радиочувствительность по тесту перестроек хромосом, то при обработке клеток необходимо учитывать, не вызывает ли применяемый агент сдвиг стадий.

Многие физические и химические факторы вызывают изменения в скорости митотического цикла, при этом разные клетки вступают в метафазу в разное время после обработки. Это приводит к тому, что сравниваются метафазы клеток, прошедшие разное количество делений и имеющие разную частоту аберраций, так как частота аберраций уменьшается с каждым последующим делением. Например, при обработке лимфоцитов мутагеном и протектором с помощью метода „арлекиновой” окраски хромосом установлено, что при фиксации лимфоцитов через 54 ч от начала культивирования лишь 25,5 % клеток находятся в первом митозе, а 73,5 % – во втором [Wolff J. и др., 1979г.]. При этом протектор не влиял на частоту аберраций, индуцированных в клетках первого митоза, но уменьшал число аберрантных клеток, вступивших во второй митоз, деление которых протекает быстрее. Эксперименты с ³Н-тимидином показали, что часть клеток второго митоза во время добавления мутагена находилась в С₂-стадии клеточного цикла, а следовательно, снижение частоты аберраций при действии протектора перед добавлением мутагена может быть артефактом клеточной селекции [Wolff J. и др., 1979г].

Таким же артефактом оказался кажущийся синергизм дальнего красного света и рентгеновского излучения [Volff S. и др., 1965г.]. Красный свет замедлял протекание клеточного цикла, и после обработки им действие рентгеновских лучей приходилось на клетки, оказавшиеся в самой чувствительной стадии.

Установлено, что введение в организм или культуральную среду ³Н-тимидина приводит не только к задержке вступления клетки в митоз, но и перескакиванию из G₂-фазы в G₁ или G₀ следующего митоза, к уменьшению периода деления клетки, гибели клеток, индукции хромосомных перестроек и т. д. [Козлов А.А. и др., 1980г.]. Все это может привести к самым неожиданным и противоречивым результатам при исследовании выхода структурных мутаций под действием ионизирующей радиации (равно, как и любого другого мутагена), и особенно при изучении совместного действия двух и более факторов.

Размер (дифференцировка) клетки. Существует две субпопуляции лимфоцитов – большие и малые. Лимфоциты большого размера устойчивы к облучению, а малые чувствительны. В процессе дифференцировки лимфоциты в значительной степени утрачивают способность к эксцизионной репарации. Обусловлено это тем, что при дифференцировке клетки возрастает спирализация и плотность упаковки ДНК, что препятствует доступу ферментов репарации к месту повреждения. При обработке клеток ФГА, который обычно используется при культивировании лимфоцитов, происходит дедифференцировка клеток, вследствие чего возрастает и их устойчивость к облучению [Филиппович И.В. и др., 1983г.]. Лимфоциты людей, больных красной волчанкой, теряют свою суперспирализацию, и поэтому в них лучше репарируются повреждения, ведущие к хромосомным перестройкам или гибели клеток. Все это приводит к различному выходу аберраций хромосом при тестировании кластогенного действия мутагенных факторов.

Диаметр и специфичность хромосомы. Радиочувствительность клеток, как оказалось, зависит и от диаметра хромосом пронуклеуса. Такой вывод был сделан на основании изучения двух популяций комаров, одна из которых обитает в Альпах, а другая – в Берлине. Частота перестроек у этих популяций различалась в 10-20 раз и коррелировала с числом витков в хромосомной спирали [Izraelewski N., 1979г.]. По мнению автора, повышенная радиочувствительность клеток с большим числом витков в хромосомной спирали объясняется тем, что каждый виток является единицей внутри- и межхромосомных контактов, ведущих к возникновению аберраций хромосом. Нам представляется возможным и другое объяснение: чем более спирализована ДНК (большее число витков), тем труднее осуществляется репарация потенциальных повреждений и выше выход структурных мутаций. Интересно, что по общей радиочувствительности эти популяции различались в 1,5 раза, что свидетельствует об отсутствии корреляции между общей и цитогенетической радиочувствительностью.

На индукцию хромосомных перестроек влияет не только величина диаметра хромосом, но и другие характеристики.

Существует мнение, что частота образования структурных мутаций в хромосомах пропорциональна их длине. Действительно, чем хромосома длиннее, тем вероятнее в ней и возникновение первичных повреждений, и формирование хромосомных перестроек. Однако обнаружено [Caspersson T. и др., 1979г.], что в разных парах хромосом частота образования аберраций различается и при этом не соответствует длине хромосомы.

К такому же выводу пришли и японские исследователи [Hayata I. и др., 1985г.] при изучении с помощью Q- и R-окрашивания хромосомных перестроек, возникающих в костном мозге крыс и мышей после v-облучения. Они показали, что частота аберраций в индивидуальных хромосомах распределена не случайным образом. Были выделены более ранимые и более резистентные хромосомы, причем было установлено, что эти показатели не коррелируют с длиной хромосом. Особенно интересно, что среди чаще всего поражаемых хромосом мыши и крысы три пары оказались гомеологичными [Hayata I. и др., 1985г].

К выводу о неравномерности распределения хромосомных повреждений во фракциях метафазных хромосом, различающихся по размеру, пришли и другие авторы [Горин А.И. и др., 1986г.].

Чувствительность участков внутри хромосомы. Все исследователи, изучавшие локализацию индуцированных хромосомных перестроек, отмечали неравномерность распределения разрывов по длине хромосомы. Это явление обычно связывают с распределением эу- и гетерохроматина, структурная организация и биохимическая дифференциация которых различны [Прокофьева-Бельговская А.А., 1960г., 1971г.]. Показано, что при различных воздействиях (ионизирующая радиация, химические вещества, температурная обработка) повреждения хромосом локализуются преимущественно в гетерохроматиновых районах хромосомы [Прокофьева-Бельговская А.А., 1960г, 1986г., Kodani M., 1941г., Христолюбова Н.Б., 1961г., Елисеева К.Г. и др., 1973г.]. Однако, несмотря на то, что аберрации хромосом в большей степени локализованы в гетерохроматиновых участках или на стыках гетеро- и эухроматина, эухроматин сильнее подвержен прямому действию повреждающих агентов (ионизирующая радиация, канцерогенные химические соединения, ДНКаза I и т. д.) [Горин А.И. и др., 1986г.]. Такое противоречие может быть связано с тем, что относительное количество первичных повреждений существенно выше в эухроматине, чем в гетерохроматиновых участках, но в последних затруднены процессы репарации [Горин А.И. и др., 1986г.].

Кроме того, были установлены и причины неравномерного распределения аберраций по длине хромосом. Так, в работе [Schubert I., 1985г.] отмечено, что «горячие» точки у многих видов выявляются в позднореплицирующемся гетерохроматине. На распределение хромосомных перестроек влияют также: 1) тип исполь­зуемого мутагена; 2) относительное положение участка внутри кариотипа; 3) наличие структурных перестроек хромосом до воздействия; 4) число потенциальных „горячих” сегментов на хромосому и т. д.

Используя предложенную Касперсоном окраску акрихин-ипритом, с помощью флуоресцентного микроскопа Холмберг [Holmberg M. и др., 1973г.] установил, что разрывы хромосом лимфоцитов человека под действием облучения возникают преимущественно в К-областях хромосом и частота разрывов в каждой хромосоме пропорциональна длине этих участков. При этом оказалось, что структурные изменения хромосом не затрагивают С-областей [Горин А.И. и др., 1986г.].

Интересно, что существуют отдельные особенно „ломкие” участки хромосом, причем они специфичны для разных генотипов. Например, при изучении двух инбредных генетически чистых линий мышей для одной из них были обнаружены 3 „ломких” участка (12А2,15А2,19А2), а для другой – один (19В). Частота клеток с „ломкими” участками 15А2 и 19В увеличивалась при добавлении ФУДР [Sanz M. и др., 1984г.]. Существует мнение, что разрывы хромосом происходят в результате не только специфического биохимического действия мутагена, но и биофизических или физико-химических напряжений [Manna G.K., 1975г.].

Сроки воздействия и фиксации. Результаты определения уровня хромосомных перестроек в соматических клетках существенно искажаются при длительном воздействии мутагенных факторов. Одной из причин этого является элиминация короткоживущих клеток, вместе с которыми элиминируются и перестройки. Тем более что вероятность гибели клеток с повреждениями выше, чем нормальных. Вторая причина – это гетерогенность клеток по чувствительности к мутагенам. Так, отмечено [Леонард А., 1986г.], что популяции лимфоцитов обладают разной чувствительностью, причем чувствительная субпопуляция активно элиминируется и приводит к снижению клеток с хромосомными нарушениями. При длительных воздействиях мутагенных агентов происходит адаптация популяций к этим мутагенам. Популяции становятся более резистентными, что также приводит к существенному занижению результатов оценки генетической опасности мутагенных факторов по сравнению с результатами исследования однократных мутагенных воздействий.

Необходимо учитывать и тот факт, что с увеличением сроков культивирования клеток в них нарастает асинхронизация. Так, даже в синхронизированной культуре лимфоцитов человека уже через 5 ч культивирования появляются клетки второго деления [Леонард А., 1986г.], через 48 ч образуется смесь клеток двух делений, а через 80 ч – пяти делений [Сапачева В.А. 1986г.].

При облучении гепаринизированной цельной крови индийских мунтжаков через 48 ч культивирования обнаружена разная частота хромосомных аберраций в метафазах 1,2 и 3-го митозов [Das B.C. и др., 1987г.]. Автором установлено, что 50 % дицентриков и 12% колец переносится из первого цикла во второй. В первом цик­ле после облучения в дозе 4 Гр было найдено 94 % аномальных клеток, а во втором – 73 %. После третьего цикла частота хромосомных нарушений существенно снижается [Das B.C. и др., 1987г]. Эти данные неоспоримо свидетельствуют о том, что нельзя изучать количественные закономерности индуцирования цитогенетических повреждений в клетке без идентификации первого и последующих клеточных делений.

Роль условий проведения опытов. На результаты цитогенетических исследований могут оказывать влияние условия проведения опыта. Например, в лимфоцитах периферической крови человека был обнаружен „эффект хранения” [Evans H.J. и др., 1980г.]. Для изучения его влияния на частоту аберраций хромосом были проведены исследования в двух вариантах. В первом варианте обработанные мутагеном лимфоциты стимулировали к делению с помощью ФГА и БДУ в течение 0-9 дней, а во втором варианте опытов ФГА и БДУ добавляли в культуру клеток сразу же после обработки мутагеном. Оказалось, что в обоих вариантах опытов частота хромосомных перестроек хроматидного и хромосомного типа интенсивно увеличивалась вплоть до последнего срока культивирования, в то время как частота СХО возрастала постепенно, достигая максимума на 6-й день, а затем начинала снижаться. Установлено, что на частоту аберраций в лимфоцитах влияют не только сроки хранения, но и температура хранения и посуда, в которой хранилась кровь перед облучением [Ivanov B.A., 1979г.]. Так, в клетках крови, хранившейся при t = 5°С в течение 173ч в пластиковых сосудах, после облучения частота аберрантных клеток была в 2 раза больше, чем в лимфоцитах свежей крови. Статистически значимое увеличение уровня хромосомных перестроек наблюдалось и при хранении крови до облучения в течение 24, 48 и 72 ч при t = 5, 20 и 37 °С. Однако хранение крови в течение 48 ч при t = 20 °С в стеклянных сосудах не повышало частоты аберраций по сравнению со свежей кровью. Был сделан вывод о сенсибилизирующем действии пластмассы на наследственные структуры лимфоцитов [Ivanov B.A., 1979г.].

Возможны и другие артефакты, влияющие на результаты генетических исследований. Так, в работе [Mitchell I.G., 1987г.] указывается, что размер проб, количество повторностей, выбор метода статистической обработки данных, а также экспериментальные артефакты и случайные ошибки могут быть причинами противоречивости данных, получаемых в разных лабораториях при исследовании одного и того же генотоксического агента. Например, к артефактам может привести также отсутствие тщательной отмывки культуры [Skare Julie A. и др., 1986г.]. В некоторых опытах даже показатели осмотического давления, концентрация ионов и рН среды влияли на результаты цитогенетических исследований [Stankowski L.F. и др., 1987г.].

Таким образом, на индукцию хромосомных перестроек в отличие от точковых мутаций влияют самые разнообразные факторы. Зависимость уровня структурных мутаций от многообразных клеточных характеристик свидетельствует о том, что образование аберраций тесно связано с метаболическими процессами в клетке, и в частности с репарационными.

Различия в индукции хромосомных и точковых мутаций, очевидно, связаны с их разной природой и разными путями становления. Так как точковые мутации – это изменения на уровне нуклеотидов ДНК, не затрагивающие белковый компонент нуклеопротеида и не нарушающие в процессе своего формирования целостность хромосомы, а для образования структурных перестроек обязательны разрыв в сахарофосфате и участие белкового компонента, то и возможности для репарации предмутационных повреждений при образовании точковых и структурных мутаций различны.

Исследования роли белково-нуклеиновых взаимодействий в репарации ДНК в клетках эукариот начаты недавно, но влияние состояния хроматина на репарацию ДНК не вызывает сомнений [Hanewalt P.S. и др., 1979г., Хансон К.П., 1981г.]. В частности, установлено, что кинетика репарации на уровне ДНК и хромосом после γ-облучения совершенно различна [Hittelman W.N. и др., 1982г.]. Это объясняется тем, что доступ ферментов репарации к ДНК в составе хроматина ограничен. Так, по данным [Bodell W.I. и др., 1979г.], структурное состояние хроматина влияет на распределение репаративного синтеза не только на уровне нуклеосом, но и на более высоких уровнях его упаковки, а по данным работы [Klug A. и др., 1981г.], доступ нуклеазы к ДНК ограничен гистоновой сердцевиной с одной стороны и прилегающим витком суперспирали ДНК – с другой. Установлено также, что изменение организации хроматина в интерфазном ядре приводит к нарушению репарационных процессов, причем упаковка ДНК в эу- и гетерохроматине хромосом находится под разным генным контролем [Gatti M. и др., 1983г.]. В некоторых случаях особенности строения хроматина могут ограничивать репарацию ДНК (например, в нестимулированных лимфоцитах и высокодифференцированных клетках хрусталика глаза) [Hanewalt P.S. и др., 1979г.].

По данным работы [Suciu D., 1985г.], плотная упаковка хроматина препятствует репарации радиационных повреждений, что способствует развитию индуцированных ядерных пикнозов. В ней приводятся факты зависимости радиочувствительности от структурных и топологических особенностей организации хроматина в интерфазных клетках и высказывается мнение, противоположное устоявшемуся в радиобиологии, о том, что радиочувствительность клеток пропорциональна объему интерфазных хромосом. В то же время при постоянном количестве ДНК радиочувствительность обратно пропорциональна объему ядра. Например, объем ядер радиочувствительных лимфоцитов колеблется от 20 до 65 мм³, тогда как для клеток печени ядерный объем достигает нескольких тысяч. Другими словами, радиочувствительность клетки прямо пропорциональна плотности упаковки ДНК при постоянном ее количестве [Suciu D., 1985г.].

Процесс созревания хроматина сопровождается повышением устойчивости ДНК к нуклеазам [Cusick M.E. и др., 1983г.]. На разных стадиях мейоза хроматин в различной степени защищен от воздействия нуклеаз, однако, по данным [Строков А.А., 1982г.], эта устойчивость не пропорциональна степени конденсации хроматина. Следовательно, кроме плотности упаковки есть и другие факторы, затрудняющие доступ нуклеаз к ДНК.

Отмечено также, что поли(АДФ)рибозилирование хроматина имеет функциональное значение для репарации ДНК, вызы­вает ослабление белково-нуклеиновых взаимодействий в участках репарации ДНК и обеспечивает их доступность для ферментов эксцизионной репарации [Хансон К.П., 1981г.]. В работе [Рапопорт И.А. и др., 1979г.] описан антимутаген ПАЕ, эффективность которого объясняется тем, что он делает ДНК доступной для ферментов репарации. И наоборот, ингибиторы топоизомераз новобиоцин и налидиксовая кислота предотвращают релаксацию суперспирализованной ДНК, что приводит к ингибированию начального этапа репарации [Mattern M.R. и др., 1982г., Mitchell David L.и др., 1986г.].

Следовательно, повреждения на уровне нуклеотидов могут быть недоступными для ферментов репарации, так как защищены „белковым футляром” [Wilkins R.J. и др., 1974г., Jackson D.A. и др., 1982г., Elgin Sarah C.R., 1983г., Davis A.H. и др., 1983г., Prior Ch. P. и др., 1983г.]. Повреждения репарабельны или нерепарабельны в зависимости от их локализации [Abel H., 1979г.]. Очевидно, часть изменений нуклеотидов ускользает от репарации: они либо не узнаются репарационными ферментами, так как не нарушают вторичную структуру молекулы, либо прикрыты белком и недоступны для репарационных ферментов. Например, не удалось зарегистрировать репарации метилированных пуринов в ДНК из экстрактов эмбрионов дрозофилы [Green D.A. и др., 1983г.]. Авторы предполагают, что отсутствие ДНК-гликозилазной активности у дрозофилы свидетельствует о недостаточности системы эксцизионной репарации для удаления модифицированных оснований в ДНК. Известно, что после хронического облучения экспериментаторы фиксируют меньшее количество индуцированных мутаций, чем после острого. Объясняется это тем, что при длительном облучении с малой мощностью дозы системы восстановления имеют больше времени и возможностей для репарации возникающих предмутационных повреждений. Например, при хроническом УФ облучении в конидиях нейроспоры возникает в 4-7 раз меньше мутаций, чем при остром.

Установлено, что при хроническом облучении у нейроспоры образуются исключительно точковые мутации, а не мультигенные делеции, как при остром [Stadler D. и др., 1987г.]. Такие точковые мутации названы „устойчивыми к репарации” и показано, что величина эффекта „доза – время облучения” (частота мутаций при остром облучении, деленная на частоту мутаций при хроническом облучении при равной общей дозе) различна для отдельных сайтов. Этот факт указывает на то, что точковые мутации могут быть связаны с определенными нуклеопротеидами или конфигурацией ДНК.

О том, что точковые мутации могут формироваться без участия репарационных ферментов, свидетельствует и работа [Slatko B.E. и др., 1984г.]. Авторами обнаружены вставки Р-транспозонов в сайтах мутаций, индуцированных при синдроме дисгенезиса у гибри­дов дрозофилы, и исследовано влияние нарушений систем ре­парации ДНК (пострепликативной и эксцизионной) у разных линий дрозофилы на активность Р-транспозонов. Оказалось, что нарушения одного или двух путей репарации не влияют на транспозицию Р-элементов. Был сделан вывод о том, что Р-транспозоны функционируют независимо от систем репара­ции ДНК и сами кодируют продукты, необходимые для осуществления процесса их транспозиции, так же, как и мобильные элементы прокариот и низших эукариот [Slatko B.E. и др., 1984г.].

Согласно современным представлениям о функционировании репаративных систем в клетках эукариот отдельные биохимические реакции репарации ДНК протекают не независимо, а взаимосвязанно и некоторые из них позволяют клетке функционировать, несмотря на присутствие повреждения, причем синтез ДНК может идти „в обход» нерепарированных повреждений [Ganesan A.K. и др., 1982г.].

Очевидно, этим и объясняются факты отсутствия репарации в клетках млекопитающих, обнаруженные в ряде работ. Так, в работе [Meyn R.E. и др., 1971г.] показано, что в некоторых линиях живот­ных клеток димеры не вырезаются. В работе [Дубинин Н.П., 1978г.] отмечается, что клетки почти всех млекопитающих вообще лишены фотореактивирующего фермента. В то же время в исследовании [Harm H., 1980г.] делается вывод о том, что в клетках роговицы глаза воз­никают „не фоторепарируемые поражения”, хотя тесты in vitro (при экстракции ДНК из этих же клеток) показывают, что фотореактивируемые поражения ДНК фактически полностью репарируются.

Нерепарабельные или нерепарированные повреждения доживают до синтеза ДНК и фиксируются в точковые мутации редупликационным механизмом [Дубинин Н.П., 1978г.].

Ряд авторов считают, что измененные основания вызывают мутации скорее путем неправильного спаривания, чем путем склонной к ошибкам репарации [Kimball R.F. и др., 1976г., Thomas H.F. и др., 1976г., Brendel M. и др., 1980г.]. Предполагается, что причиной возникновения ошибок спаривания является ионизация оснований ДНК [Lowley P.D. и др., 1961г., Krieg D.R., 1963г.]. В работе [Goodman M.F. и др., 1981г.] показано, что частота образующихся ошибочных спариваний оснований не согласуется с таутомерной моделью. Предполагается, что выбор нуклеотидов управляется не ферментом, а различиями в свободных энергиях спаривания оснований, так как отдельные водородные связи обладают различной связывающей способностью в зависимости от их расположения.

Механизм образования замены пар оснований путем неправильного спаривания описан в ряде работ [Drake G.W. и др., 1976г., Eisenstadt E. и др., 1982г., Тарасов В.А., 1982г., Singer B., 1981г., Janion C., 1984г.]. Например, в работе [Дубинин Н.П. и др., 1986г.] приводится схема образования и фиксации мутаций путем встраивания измененного основания при вегетативной репликации и делается вывод о том, что фиксация мутаций определенного типа зависит не от эксцизионной репарации, а от вегетативной репликации ДНК. При этом событием, фиксирующим мутации, является ошибка репликации на данном участке ДНК.

Известно несколько типов процессов ошибочного спаривания оснований. Среди них – таутомеризация, ионизация и конформационные изменения (анти -син -вращение пуринов и неоднозначное образование пар оснований). Ряд американских исследователей [Sowers L.S. и др., 1987г.] рассмотрели процесс образования водородных связей между нормальными и модифицированными азотистыми основаниями с новых позиций. Термодинамические исследования ионизации и таутомеризации оснований позволили авторам сделать вывод о важности ионизированных структур для стабилизации модифицированной ДНК в физиологических условиях и о связи между способностью к ошибочному спариванию измененных мутагеном оснований и образованием ионизированных пар оснований.

На репарацию ДНК у эукариот большое влияние оказывает хроматин. Возможно, из-за этого число генов, контролирующих репарацию у высших организмов, больше, чем у прокариот. По мнению Кимбелла [Kimball R.F., 1987г.], реальные процессы репарации у эукариот еще требуют своего выяснения. Это связано с тем, что ДНК в клетке взаимодействует с различными белками, образуя надмолекулярные структуры высших порядков – хроматин, хромосомы, и эффекты ионизирующей радиации в клетке отличаются от того, что можно ожидать, исходя из опытов по облучению ДНК в растворах (Андреев С.Г. и др. 2003г).

Таким образом, существуют различия в становлении точковых и структурных мутаций и, в частности, в зависимости выхода этих двух типов мутаций от эффективности репарационных процессов в клетке. Ряд авторов [Fujikawa K.и др., 1979г, Nataradjan A.T. и др., 1981г.] приходят к выводу, что аберрации хромосом и точковые мутации являются следствиями разных типов первичных повреждений и репарационных путей. Различие репарационных путей становления этих двух типов мутаций не вызывает сомнений. Но различны ли первичные повреждения, приводящие к точковым и хромосомным мутациям? Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об обратном.

Общность происхождения хромосомных
и точковых мутаций

Ряд современных данных свидетельствует о возможной связи между первичными повреждениями азотистых оснований и формированием хромосомных перестроек. Рассмотрим некоторые из них.

1. Неионизирующие излучения и химические мутагены не способны вызывать фосфодиэфирные и межуглеродные разрывы. Для них характерны лишь реакции, обусловливающие потери и модификации оснований. Тем не менее, эти мутагены образуют такие же структурные перестройки хромосом, как и ионизирующие излучения.

2. При введении в пиримидиновое ядро заместителей Br, Cl и при включении в ДНК БДУ возникают спонтанные и увеличивается выход индуцированных УФ и рентгеновским излучением аберраций хромосом [San S.J.S. и др., 1980г., Nataradjan A.T. и др., 1981г., Obe L. и др.,1981г.].

При этом радиочувствительность хроматид зависит от степени замещения тимидина ДНК на БДУ. При замещении более чем на 60 % количество разрывов в облученных хроматидах в 3 раза выше, чем при отсутствии замещения [Wollf S и др., 1981г.]. Установлено, что в бромурацильной ДНК под действием УФ и рентгеновского излучения цепочка реакций начинается с диссоциации атома брома, затем происходят свободнорадикальные превращения сахарного остатка, что приводит в конечном итоге к одиночному разрыву сахарофосфатного остова и образованию структурных мутаций хромосом [Hatchinson F. и др., 1970г.].

3. Химический распад оснований в ДНК, например дезаминирование, может содействовать разрыву водородных связей [Шальнов М.И.,1973г.]. Кроме того, „стопка” оснований может рассыпаться и без разрыва полинуклеотидной цепи в тех местах, где межплоскостное взаимодействие оснований нарушается вследствие потери или модификации одного из нуклеотидов. Эти факты указывают на то, что разрывы нити ДНК могут быть следствием нестабильности цепи, создавшейся в результате потери или модификации нуклеотидов.

4. К аналогичному выводу приводят и данные о реплицирующейся нестабильности хромосом, при которой разрывы хромосом возникают спустя десятки клеточных поколений после облучения. Следовательно, имеет место репликация предмутационных потенциальных изменений, ведущих к аберрациям хромосом. Отсюда вытекает, что молекулярной сущностью таких потенциальных изменений должны быть изменения нуклеотидной последовательности в ДНК, так как данных о том, что в ДНК может реплицироваться что-либо другое, нет.

5. Ионизирующая радиация может вызвать активацию транспозируемых элементов, находившихся ранее в неактивном состоянии [McClintock B., 1984г.]. Транспозоны, меняющие порядок расположения нуклеотидов, повышают темп образования как точковых, так и хромосомных мутаций [Голубовский М.Д., 1982г.]. Транслокация транспозонов сопровождается крупными делециями и инверсиями [Schubert I., 1985г.].

6. Определенные индуцированные повреждения ДНК -межнитевые сшивки типа димеров тимина – служат причиной образования аберраций хромосом [Liu V.W. и др., 1981г.].

Таким образом, можно сделать вывод о том, что при действии облучения на ДНК первичные реакции начинаются с повреждения азотистых оснований. Часть из них (возможно, нерепарабельные или нерепарированные по разным причинам) фиксируются в виде точковых мутаций. Другие могут быть основой для появления структурных мутации хромосом.

Мутационные замены аминокислот бывают двух типов: 1) не нарушающие α- или β-спиральной конформации; 2) приводящие к их повреждению разной тяжести: разрушению N-или С-концов, переходу из α- в β -спиральную конформацию и наоборот или разлому исходной вторичной структуры с образованием двух новых [Колчанов В.А.,1981г., Колчанов В.А. и др., 1977г.].

Может быть, мутационные изменения первого типа, не нарушающие конформации хроматина, не подвергаются воздействию репарационных ферментов и дают начало точковым мутациям, а повреждения второго типа приводят путем различных взаимодействий друг с другом и ферментами репарации к образованию хромосомных перестроек?

В 1980 г. была выдвинута гипотеза, согласно которой в основе инициации хромосомных перестроек лежат нарушения оснований ДНК [Preston R.I., 1980г.]. Эта гипотеза – итог многолетних исследований механизмов образования аберраций хромосом, в ходе которых было установлено, что при действии репарационных ферментов на поврежденные основания ДНК образуются одиночные разрывы хромосом, которые в свою очередь ферментативно преобразуются в двойные разрывы, дающие начало структурным мутациям [Brender M.A. и др., 1974г.].

Примерно 2 % всех повреждений ДНК инициируют хромосомные аберрации [Ганасси Е.Э. и др., 1987г., Заичкина С.И. и др., 1986г.]. Поскольку в ядре 1% всей ДНК представлено якорной ДНК, предполагается, что молекулярные изменения именно в якорной ДНК являются причиной хромосомного мутагенеза, а повреждения в других участках не приводят к нарушению структурной целостности хромосомы.

Молекулярные аспекты проблемы „горячих точек” в мутагенезе рассматриваются в работе [Тоомпуу О.Г., 1987г.], в которой указывается, что мутации типа замены пар оснований и типа сдвига рамки считывания часто обнаруживаются в участках ДНК с повторами и в асимметричных сайтах квазипалиндромов. Повторы одного или нескольких нуклеотидов являются предпосылкой для смещенного встраивания комплементарных нитей ДНК с образованием свободных от водородных связей петель. Квазипалиндромы имеют крестообразную структуру, в которой сайты асимметрии также создают петли. Мутации, по мнению автора, возникают по местам петель в результате либо эксцизионной репарации, либо аберрантной репликации.

Таким образом, индуцированные облучением точковые мутации формируются в более короткий промежуток времени и в меньшей степени, чем хромосомные перестройки, зависят от различных внутриклеточных процессов, в том числе и репарационных. К тому же в формировании перестроек хромосом существенную роль играет и белок как составная часть хромосомы, что несомненно влияет на репарацию предмутационных изменений.

Сформированные мутации в зависимости от своего функционального значения приводят или к изменению генотипа, или к гибели клетки (см. рис. 1.1).

Следовательно, если первичные повреждения азотистых оснований не подвергаются воздействию репарационных ферментов (из-за нерепарабельности или недоступности повреждений для этих ферментов), то они фиксируются в виде точковых мутаций. Если же системы восстановления узнают измененное основание и взаимодействуют с ним, то повреждение либо восстанавливается к норме, либо дает начало образованию хромосомной перестройки.

Однако нельзя забывать, что всё это справедливо только для эукариот, имеющих ДНК, сложно упакованную в составе интерфазных хромосом (Андреев С.Г., 2003г), и только для ионизирующих излучений, способных повреждать нуклеотидные основания ДНК, не повреждая его надмолекулярной структуры.