Змістковий модуль 6

ЗАНЯТТЯ 3 (2години)

Тема: Механізм дії ферментів і кінетика ферментативних реакцій. Визначення активності ферментів.

Актуальність. У сучасній біохімії широко застосовують методи визначення активності ферментів у біологічних рідинах та тканинах. Це дозволяє встановити патогенез багатьох захворювань і запропонувати методи їх лікування з використанням сучасних лікарських засобів.

Мета. Вміти аналізувати механізми дії ферментів та кінетику ферментативних реакцій. Ознайомитися з методами якісного та кількісного визначення активності ферментів у біологічних об’єктах, що дозволяють вивчити властивості ферментів і особливості їхньої дії та регуляції, а також складають основу діагнозу та прогнозу багатьох захворювань. Визначити специфічність дії ферментів α-амілази слини та сахарази дріжджів.

ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ

ПІД ЧАС ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1. Сучасні положення про механізм дії ферментів: поняття про енергію активації реакції; утворення фермент-субстратного комплексу і меха­нізми отримання продуктів ферментативної реакції (ковалентний та кис­лотно-лужний каталіз). Значення робіт Е. Фішера і Д. Кошленда.

2. Кінетика ферментативних реакцій: вплив концентрації субстрату і ферменту на швидкість ферментативної реакції (графічні залежності). Рівняння Міхаеліса-Ментен. Константа Міхаеліса, її визначення і значення.

3. Активність ферментів. Одиниці виміру активності та кількості ферментів: міжнародні одиниці, катал, питома активність.

4. Фактори, що впливають на активність ферментів: концентрація субстрату, ферменту та продуктів реакції, температура, рН середовища.

5. Методи виділення ферментів із біооб'єктів, їх фракціонування (ультрацентрифугування, гель- та іонообмінна хроматографія, афінна хроматографія, електрофорез) і аналіз активності ферментів.

6. Методи визначення активності ферментів: за кількістю продукту, який утворюється під дією ферменту за одиницю часу; за кількістю витраченого субстрату за одиницю часу. Спектрофотометричні методи визначення активності ферментів та візуалізація результатів ферментативної реакції.

ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ

1. Константа Міхаеліса для ферменту визначає:

А. Ступінь спорідненості ферменту до продукту реакції.

В. Ступінь спорідненості ферменту до субстрату.

С. Ступінь спорідненості ферменту до інгібітору.

D. Середню швидкість ферментативної реакції.

Е. Максимальну швидкість ферментативної реакції.

2. Продовжіть фразу "Незначна зміна рН середовища впливає на молекулу ферменту, змінюючи…"

А. Структурний рівень організації молекули ферменту.

В. Ступінь поляризації амінокислотних радикалів в активному центрі.

С. Товщину гідратної оболонки ферменту.

D. Оптичні властивості ферменту.

Е. Біологічну функцію ферменту.

3. Назвіть показник, який використовують при визначенні питомої активності ферменту, коли відома його загальна активність.

А. Концентрація даного ферменту в досліджуваній пробі.

В. Концентрація білка в досліджуваній пробі.

С. Концентрація субстрату в досліджуваній пробі

D. Константа Міхаеліса для даного ферменту.

Е. Максимальна швидкість досліджуваної ферментативної реакції.

4. Укажіть прізвище вченого, який запропонував гіпотезу "індукованої відповідності".

А. Г. Кребс.

В. Д. Кошленд.

С. М. Ментен.

D. Ф. Крик.

Е. К. Функ.

5. Виберіть фактор, який не впливає на значення константи дисоціації фермент-субстратного комплексу.

А. Концентрація субстрату.

В. Хімічна природа ферменту.

С. Концентрація ферменту.

D. Концентрація фермент-субстратного комплексу.

Е. Ступінь спорідненості ферменту до субстрату.

6. Що відбувається у ході ферментативного каталізу при утворенні фермент-субстратного комплексу?

А. Змінюється конформація субстрату.

В. Змінюється конформація ферменту.

С. Встановлюється індукована комплементарна відповідність між ферментом і субстратом.

D. Зближуються функціональні групи, що беруть участь у каталізі.

7. Яка з перелічених властивостей ферментів лежить в основі їх якісного та кількісного визначення у біологічних об’єктах?

А. Здатність проявляти максимальну активність при визначеному рів­ні рН середовища.

В. Залежність від присутності у середовищі різноманітних активаторів та інгібіторів.

С. Специфічність.

D. Термолабільність.

Е. Гальмування реакції її продуктами.

8. У пробірку з невідомим субстратом додали екстракт із дріжджів. Після 15 хв інкубації суміш у пробірці дала позитивну реакцію Фелінга. Який субстрат був у пробірці?

А. Крохмаль.

В. Сахароза.

С. Лактоза.

D. Глікоген.

Е. Целюлоза.

9. Що лежить в основі механізму дії ферментів?

А. Зближення груп, які входять до активного центру ферменту.

В. Утворення фермент-субстратного комплексу.

С. Зміна електричного заряду ферменту.

D. Зміна просторової конфігурації.

Е. Гідроліз ферменту.

10. Укажіть метод досліджень, який використовують для виділення ферментативних систем окремих субклітинних фракцій із гомогенату тканини

А. Діаліз.	D. Диференційне центрифугування.
В. Ізоелектричне фокусування.	Е. Рентґеноструктурний аналіз.
С. Якісний аналіз.

11. Назвіть одиницю активності ферменту, яка визначається кількістю ферменту, що перетворює 1 моль субстрату за 1 с за оптимальних умов.

А. Катал.	D. Число оборотів.
В. Стандартна міжнародна одиниця.	Е. Молярна активність.
С. Умовна одиниця.

ПРАКТИЧНА РОБОТА

Визначення специфічності дії ферментів α-амілази слини

(α-1,4-глюкан-4-глюканогідролази; КФ 3.2.1.1) та сахарази дріжджів (β-D-фруктофуранозидфруктогідролази; КФ 3.1.1.26)

Завдання 1. Приготувати екстракт із дріжджів, який містить фермент сахаразу.

Хід роботи. Розтерти у ступці шматочок дріжджів із 10–15 мл дистильованої води та профільтрувати.

Завдання 2. Перевірити дію амілази на крохмаль і сахарозу.

Принцип. Про активність ферменту судять за його дією на субстрат: за зникненням субстрату або появою продуктів його розщеплення. Розщеплення крохмалю виявляють за негативною реакцією з реактивом Люголя. Розщеплення сахарози виявляють за позитивною реакцією з реактивом Фелінга, яку дають продукти гідролізу сахарози (глюкоза і фруктоза), але не дає сахароза.

Хід роботи. У дві пробірки вносять по 0,5–1 мл слини: у першу додають 3–5 мл 1% розчину крохмалю, у другу – 3–5 мл 1% розчину сахарози, добре перемішують і ставлять у термостат при 37°С на 15–20 хв. Після цього у першу пробірку додають 3–4 краплі реактиву Люголя і переконуються в гідролізі крохмалю; зі вмістом другої пробірки проводять реакцію Фелінга і переконуються у відсутності гідролізу сахарози.

Техніка реакції Фелінга: до1–2 мл досліджуваного розчину додають однаковий об’єм реактиву Фелінга (CuSО₄ + NaOH) та кип’ятять у полум’ї горілки. За наявності у розчині моносахаридів випадає осад червоного кольору (Сu₂О), який утворюється в результаті відновлення міді завдяки окисленню карбонільних груп моносахаридів.

Завдання 3. Перевірити дію сахарази на крохмаль і cахарозу.

Принцип: той же.

Хід роботи. У дві пробірки вносять по 0,5–1 мл екстракту дріжджів; у першу додають 3–5 мл 1% розчину крохмалю, у другу – 3–5 мл 1% розчину сахарози, добре перемішують і ставлять у термостат при температурі 37 °С на 15–20 хв. Після цього у першу пробірку додають 3–4 крап­лі реактиву Люголя і переконуються у відсутності гідролізу крохмалю; зі вмістом другої пробірки проводять реакцію Фелінга і переконуються у наявності гідролізу сахарози.

Оформлення роботи: заповнити таблицю.

№ пробірки

Фермент

Субстрат

Умови досліду

Результати реакції

Висновки

Практичне значення. Ферменти, що мають абсолютну субстратну специфічність, використовуються у клініці як аналітичні реагенти для визначення речовин, що є їх субстратами. Наприклад, уреазу застосовують для визначення сечовини в біологічному матеріалі та лікарських препаратах; глюкозооксидазу – для визначення кількості глюкози в крові та сечі. Ферменти з абсолютною та відносною груповою субстратною специфічністю мають меншу вибірковість дії на субстрати і, як правило, беруть участь у гідролізі поживних речовин або перетворенні чужорідних сполук. Наприклад, α-амілаза і сахараза проявляють специ­фічність не до структури субстрату в цілому, а до типу глікозидних зв’язків, що мають місце у відповідних вуглеводах.