Проведение исследования

Для выращивания бактериальных культур навеску продукта, не менее 25 г, или смыва не менее 25 см³ высевают в пептонно-буферную воду, приготовленную в соотношении 1:5. Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 16—24 ч. Затем 10 см³ культуры из пептонно-буферной воды пересевают в 90 см³ одной из сред обогащения (Мюллера, Кауфмана, селенитовую, селенит-цистиновую, магниевую). Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 24—48 ч.

Через 24 и 48 ч со второй среды обогащения пересевают на любые дифференциальные среды – Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар и другие — по выбору. Посевы на всех средах, кроме висмут-сульфитного агара, инкубируют в течение 18-24 ч, а на висмут-сульфитном агаре при отсутствии роста подозрительных колоний инкубируют (48±1) ч при (37±1)°С.

Сальмонеллы на средах Эндо и Плоскирева растут в виде бесцветных колоний, на среде Левина — голубоватых, на висмут-сульфитном агаре — обычно в виде черных колоний с металлическим блеском с окраской среды под колониями в черный цвет. S. typhi и некоторые другие на висмут-сульфитном агаре растут в виде бесцветных или светло-зеленых колоний без окраски среды под колониями. На агаре с бриллиантовым зеленым и феноловым красным типичные сальмонеллы имеют розовую окраску.

При отсутствии подозрительных колоний на дифференциальных средах работу с посевами прекращают. Подозрительные колонии используют в дальнейших исследованиях.

Биохимические свойства культуры определяют путем исследования не менее пяти подозрительных колоний, выросших на дифференциальной среде. Определяют расщепление сахаров, мочевины, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), утилизацию цитрата, расщепление аминокислот.

Для выявления расщепления сахаров используют либо среды Гисса, либо одну из комбинированных сред (Клиглера, Ресселя, агар тройной сахарный).

Для посевов в среды Гисса часть каждой из пяти отобранных подозрительных колоний снимают бактериологической петлей, размешивают в 0,5-1 см³ стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь засевают в среды Гисса, инкубируют при (37±1)°С в течение 12 – 18 ч, после чего посевы просматривают. При образовании кислоты меняется цвет среды.

Посев на одну из комбинированных сред проводят на скошенную часть и уколом в столбик. Посевы инкубируют при (37±1)°С, учет проводят через (24±1) ч.

При ферментации лактозы, сахарозы в скошенной части столбика комбинированных сред происходит пожелтение. Покраснение или пожелтение самого столбика указывает на расщепление глюкозы.

Сальмонеллы не разлагают лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу с образованием кислоты и газа, а маннит – с образованием кислоты.

Для выявления расщепления мочевины используют одну из сред: агар тройной сахарный или скошенный агар с мочевиной.

Восстановление изменившегося цвета среды агара тройного сахарного при расщеплении глюкозы с красного или желтого цвета до бледно-розового свидетельствует о расщеплении мочевины.

Посевы на поверхность скошенного агара с мочевиной инкубируют при температуре (37±1)^оС в течение (24±1) ч. Окрашивание среды в красный цвет происходит при расщеплении мочевины. Отсутствие изменения окраски — отрицательная реакция.

Сальмонеллы мочевину не расщепляют.

Для выявления образования индола проводят посев в одну из питательных сред: 1%-ную пептонную воду или в триптон-триптофановую среду. Посевы инкубируют при (37±1)^о С в течение (24±1) ч.

В пробирки с суточной культурой добавляют 5—10 капель одного из реактивов: Эрлиха или Ковача. В первом случае при наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии – кольцо остается светло-желтого цвета. Во втором случае после взбалтывания результаты учитывают через 10 мин; реактив поднимается на поверхность среды при наличии индола окрашивается в темно-красный цвет.

В пробирку с суточной культурой в триптон-триптофановой среде добавляют 1 см³ реактива Эрлиха или Ковача. Темно-красное кольцо — реакция положительная; коричнево-желтое кольцо — реакция отрицательная.

Сальмонеллы индола не образуют.

Для выявления образования сероводорода используют одну из питательных сред: агар тройной сахарный, или среду Клиглера, или 1%-ную пептонную воду. Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 24—72 ч.

При посеве культуры в одну из комбинированных сред об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

При посеве культуры в 1%-ную пептонную воду в пробирку под пробку помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченную уксуснокислым свинцом и высушенную. Полоска не должна соприкасаться с питательной средой. При выделении культурой сероводорода через 24 — 72 ч инкубированиябумажка с уксуснокислым свинцом чернеет. Сальмонеллы выделяют сероводород.

Для выявления утилизации цитрата культуру высевают на скошенный столбик агара Симмонса, инкубируют при (37±1)⁰С в течение (24±1) ч. Окрашивание среды в синий цвет — положительная реакция, отсутствие изменений— отрицательная реакция.

Сальмонеллы, за небольшим исключением, дают положительную реакцию.

Для выявления способности культуры к образованию ацетилметил-карбинола (реакция Фогес-Проскауэра) засевают ее на среду Кларка. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение (24±3) ч, после чего переносят 1 см³ посева в пустую пробирку, добавляют 0,2 см³ раствора гидроокиси калия, 0,6 см³ раствора альфа-нафтола и несколько кристаллов креатина. Пробирки тщательно встряхивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. При наличии ацетилметил-карбинола среда окрашивается в розовый цвет. При отрицательной реакции остаток среды инкубируют еще 24 ч и тест повторяют. Сальмонеллы имеют отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра.

Для определения расщепления аминокислот культуру высевают методом укола в пробирку со столбиком агаризованнойсреды с одной из аминокислот, инкубируют при температуре (37±1)⁰С в течение (24±3) ч.

При декарбоксилировании лизина появляется темно-красная окраска. При отрицательной реакции окраска желтая. Сальмонеллы декарбоксилируют лизин.

Для теста расщепления фенилаланина культуру высевают на поверхность скошенного агара, инкубируют при температуре 37⁰С в течение 24 ч, затем на поверхность среды наносят 3 капли хлорного железа. Появление зеленой окраски среды – положительная реакция, цвет среды не изменяется – отрицательная реакция. Сальмонеллы дают отрицательную реакцию.

Для выявления подвижности культуру высевают методом укола в пробирку со столбиком полужидкого агара. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч.

О наличии подвижности свидетельствуют диффузный рост вокруг укола и помутнение столбика агара.

Серологические реакции проводят с суточной культурой, выросшей на агаризованной среде.

Определяют чистые колонии на способность самоагглютинации и на присутствие О, Vi, Н – антигенов сальмонелл.

При этом на предметное стекло помещают каплю физиологического раствора, а рядом каплю одной из антисальмонеллезных сывороток (поливалентную О-сыворотку отдельных О-групп и другие).

Растирают в капле некоторое количество исследуемой культуры до получения однородной мутной суспензии. Покачивают стекло в течение 30-60 с, затем помещают на темный фон и рассматривают. При агглютинации образуются хлопья, комочки.

Штаммы считаются самоагглютинирующими при образовании хлопьев, комочков в капле физиологического раствора, и они серологическому подтверждению не подлежат.

При получении положительной реакции с поливалентной О-сывороткой культуру испытывают с сыворотками к антигенам отдельных О-групп, входящих в поливалентные сыворотки.

Для выявления Vi-антигена исследуемую культуру испытывают с моновалентной Vi-сывороткой; Н-антигенов – с моновалентными Н-сыворотками.

Для выявления Н-антигена в реакции агглютинации следует использовать культуру с нижней, более влажной части скошенного агара, в которой лучше развит Н-антиген.

Положительная реакция – агглютинация бактерий, отрицательная реакция – отсутствие агглютинации. Сальмонеллы дают положительную реакцию.

На основании серологических исследований подтверждают или исключают принадлежность выделенной культуры к роду сальмонелл.