Метод определения лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

ЛДГ – гликолитический фермент, катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную. Скорость окисления NADH в NAD пропорциональна активности ЛДГ.

ЛДГ состоит из 5 изоферментов, представляющих собой различные комбинации двух типов (Н и М) полипептидных цепей. ЛДГ₁ представляет собой идентичные Н цепи (ЛДГ₁), преобладает в ткани сердца.

ЛДГ₅ состоит из 4 полипептидных цепей М – преобладает в мышечной ткани, остальные три фермента представляют собой различные сочетания М и Н-цепей. Для определения изоферментов наиболее распространенными являются электрофоретические методы.

Имеются методы, основанные на различном отношении ЛДГ₁ и ЛДГ₅ к температуре и действию мочевины. Мочевина действует как ингибитор и тормозит ЛДГ₅ почти на 100%. Унифицированным методом является колориметрический динитрофенилгидразиновый метод.

Принцип метода: различие спектров поглощения окисленной и восстановленной форм NAD при 340 нм.

Реактивы:

1. Фосфат калия однозамещенный (КН₂РО₄);

2. Калий фосфат двузамещенный 3-водный (КН₂РО₄ х 3Н₂О);

3. Натрия пируват.

4. Никотинамиддениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль;

5. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4 с раствором NADH 0,165 ммоль/л и раствором пирувата натрия 0,00103 моль/л: 0,16 г однозамещенного фосфата калия, 2,07 г двузамещенного фосфата калия, 0, 0117 г NADH и 0,0114 г пирувата натрия растворяют в 40- 60 мл 0,1 моль/л фосфатном буфере, доводят рН и доливают водой в мерной колбе до 100 мл.

6. Натрия хлорид, 154 ммоль/ л.

Ход определения: в рабочий реагент (буфер с NADH и пируватом) добавить сыворотку крови в соотношении 50: 1 (например, 1,0 мл рабочего реагента + 0,02 мл сыворотки), перемешать и через 1 мин. Начинать считывать изменение экстинкции за 1 минуту:

Расчет: при 25°С.

U/л 15000. Е 365/мин

U/л 8095. Е 340/мин

U/л 8250. Е 334/мин

1 U/л = 16,67 нмоль/с.л.

Нормальные величины в сыворотке крови при 25 °С 120-240 U/л.