На грани фантастики

Как же можно использовать созданный криобанк? Как получить из замороженных клеток новый организм, генетически тождественный тому, от которого взята клетка для консервации? Путей здесь несколько, все они трудоемки, сложны, но отнюдь не безнадежны. И не переходят грани фантастики!

Способы получения живых клеток из замороженных спермиев. В том случае, если от исчезнувшего вида сохранились только мужские половые клетки, задача воссоздания живых животных может быть решена двумя способами - оплодотворением такими спермиями яйцеклетки самки другого вида, т.е. межвидовой гибридизацией; или обеспечением развития такой яйцеклетки без материнского генома, т.е. андрогенетически.

Нескрещиваемость с другими видами обычно рассматривается как один из признаков вида; однако в ряде случаев возможна межвидовая (амфибии), межвидовая и межродовая (птицы, млекопитаю­щие) и даже межвидовая, межродовая и межподсемейственная гибридизация (рыбы). В тех случаях, когда виды не скрещиваются, это может быть обусловлено, помимо поведенческих реакций, различными причинами. Во-первых, спермии могут оказаться нежизнеспособными в половых путях самки. В таком случае применяют оплодотворение in vitro с последующей имплантацией зиготы самке вида-донора яйцеклетки. Для млекопитающих такое оплодотворение уже удалось осуществить на 14 видах. В тех случаях, когда спермий не способен проникнуть в яйцеклетку, применяют инъекцию обработанных протеолитическими ферментами спермиев непосредственно в цитоплазму яйцеклетки или осеменение яйцеклетки с предварительно удаленной оболочкой.

Второй способ восстановить исчезнувший вид, от которого сохранились только сперматозоиды - обеспечить андрогенетическое развитие гибридной зиготы, не содержащей женского генома. Очевидно, первые этапы этой работы такие же, как при межвидовой гибридизации. Женское ядро удаляется хирургически или инактивируется температурной или радиационной обработкой; диплоидность полученных зародышей может быть обеспечена той же тепловой обработкой, способствующей слиянию двух мужских пронуклеусов при полиспермном осеменении или подавлением первого деления дробления цитохалазином. Однако несмотря на многочисленные попытки, способные к размножению андрогенетические особи получены только у очень ограниченного числа животных - костистых рыб, некоторых насекомых и аксолотля. Андрогенетические межвидовые гибриды, полученные у амфибий и рыб были нежизнеспособны. В конце 1970-х - начале 1980-х годов появились сообщения о получении андрогенетических детенышей мыши. Однако при проверке эти данные не подтвердились, и было достоверно показано, что для развития млекопитающих необходимо присутствие обоих пронуклеусов или одного из пронуклеусов и ядра зародыша противоположного пола. Развитие андрогенетического зародыша возможно также при сращивании его с зиготическим зародышем (получении химеры). Попытки получить гетероспермный андрогенез у млекопитающих не предпринимались. Таким образом, на сегодня реальный путь воссоздания живых исчезнувших видов, от которых сохранились только криоконсервированные сперматозоиды - межвидовая гибридизация с последующим повышением кровности посредством поглотительных скрещиваний.

Способы получения живых животных из замороженных женских половых клеток. Развитие яйца без участия спермия - партеногенез - встречается в природе почти во всех группах беспозвоночных и у десятков видов позвоночных - рыб, амфибий, рептилий, птиц. В эксперименте партеногенетическое развитие с последующим восстановлением диплоидности обработкой яиц цитохалазином было получено у червей, моллюсков, иглокожих, амфибий. Большое практическое значение имеет диплоидно-партеногенетическое развитие тутового шелкопряда. У млекопитающих все попытки получения партеногенеза, вызванные его важностью для селекционной работы, пока были безуспешны; максимальная стадия развития, достигнутая диплоидно-партеногенетическими зародышами мыши - стадия почек конечности (25 сомитов). Однако в химере с зиготическими зародышами ткани партеногенетического зародыша могут успешно развиваться и даже образовать половые клетки.

Гиногенетическое развитие, т.е. развитие зиготы без отцовского генома, как правило, оказывается более полноценным, чем партеногенетическое, что связано, очевидно, с участием в развитии цитоплазматического компонента, вносимого спермием. В природе диплоидно-гиногенетическое развитие наблюдается у видов или популяций, у которых самцы неизвестны; яйцеклетки осеменяются спермиями другого вида, ядра которых не участвуют в развитии. Такой гиногенез известен у рыб, амфибий, червей. В эксперименте искус­ственное гиногенетическое развитие получают также, применяя сперму другого вида или обработанную факторами, инактивирующими ядро. Диплоидность восстанавливают, подавляя деления созревания температурной обработкой или высоким давлением. Такие диплоидно-гиногенетические особи развиваются до взрослого состояния у костистых рыб и амфибий. У млекопитающих гиногенетическое развитие, как и андро- и партеногенетическое, возможно только в химере с зиготическим зародышем.

Как уже отмечалось, женские половые клетки легче сохранить на ранних стадиях их развития, в яичниках. Очевидно, что в случае исчезновения вида, от которого сохранились только замороженные яичники, их придется имплантировать самке другого вида. Осуществление межвидовых пересадок незамороженных яичников у насекомых, хвостатых амфибий, птиц позволяет надеяться на успех подобных опытов и с замороженными яичниками.

В случае сохранения соматических клеток их генетическая информация может быть реализована путем пересадки их ядер в цитоплазму энуклеированной яйцеклетки. Такие пересадки были осуществлены, начиная с 1952 года у многих видов амфибий, рыб, насекомых, асцидий. Однако ни в одном из этих опытов не удавалось довести развитие яйцеклетки с ядром взрослого животного до половозрелого состояния - удается получить личинки из яйцеклеток с ядрами соматических клеток взрослых животных и взрослых животных - из яйцеклеток с ядрами клеток личинок. Что касается млекопитающих, то максимальный возраст донора, ядра которого способны обеспечить развитие до рождения, ограничен стадией 8-16 бластомеров.

Очевидно, что восстановление вида, геном которого сохранен только в соматических клетках, возможно лишь при пересадке их ядер в яйцеклетки другого вида. Подобные опыты успешно осуществлены на 25 видах амфибий (в 13 комбинациях яйцеклетки с ядрами бластулы другого вида развивались до стадии личинки или взрослой особи).

Следующая задача, стоящая при реализации генетической информации, сохраненной в законсервированных клетках - обеспечение развития зиготы. Следует отметить один важный методический прием, который может обеспечить развитие нежизнеспособных зигот, полученных одним из перечисленных способов - это получение химерных зародышей, т.е. сращивание нежизнеспособного зародыша гибридного происхождения с зародышем одного из родительских видов. В составе такой химеры ткани нежизнеспособного зародыша успешно развиваются и способны образовывать половые клетки. Таким же образом удается получить потомство от животных партеногенетического происхождения.

При получении зародышей млекопитающих исследователь сталкивается с еще одной трудностью - необходимостью обеспечить такому зародышу «приемную мать». Попытки довести до рождения развитие млекопитающих in vitro неизменно оканчиваются неудачей. Однако уже в 1890 году появилось сообщение об успешном развитии до рождения зародышей кролика, пересаженных в матку другой самки. К настоящему времени пересадки зигот осуществлены уже у 25 видов млекопитающих. Этот метод является необходимым для обеспечения развития зародышей млекопитающих, хранившихся в замороженном состоянии, что широко применяется в настоящее время в практике сельского хозяйства и биологического эксперимента. Однако попытки осуществить развитие зародыша в матке самки другого вида оканчивались неудачей до 1977 года, когда удалось добиться рождения ягненка муфлона, родившегося из зародыша, пересаженного домашней овце. К настоящему времени таким путем удалось получить детенышей, рожденных матерями другого вида, в 12 комбинациях. В тех случаях, когда такой путь оказывается невозможным, применяют другой - получают химерных зародышей между зародышами двух видов и вводят их в матку самки одного из видов. Такие опыты успешно осуществлены в трех комбинациях нескрещивающихся видов.

Существенные трудности связаны с обеспечением развития замороженных зародышей птиц. Замораживание целых яиц не удается вследствие больших размеров желтка; проводятся опыты по замораживанию изолированных зародышей. Дальнейшее их развитие возможно при применении трех способов:

- создании химер, о чем говорилось выше; этот метод хорошо разработан для птиц и остистых рыб;

- пересадке размороженного зародыша на желток яйца другого вида;

- культивировании in vitro.

Попытки пересадки изолированных зародышей птиц на желток яйца другого вида неизвестны, хотя пересадка целого желтка зародыша курицы в скорлупу с белком яйца индюшки дала положительные результаты. Наконец, появилось сообщение об успешном развитии до «вылупления» изолированного куриного зародыша на искусственной среде. Таким образом, проблема реализации генетической информации, сохраненной в изолированных зародышах птиц, в принципе представляется решаемой.

Наконец, следующая задача, встающая при разведении животных, восстановленных из законсервированных геномов - получение обоеполой популяции. Дело в том, что при некоторых способах вос­создания живых животных (андро-, партено- и гиногенезе у некоторых видов) все полученные особи оказываются однополыми. В таком случае необходимо произвести переопределение пола части особей, что легко удается с помощью гормональных и некоторых других воздействий у рыб, амфибий и птиц. У млекопитающих известно спонтанное переопределение пола, обусловленное генетическими факторами, но оно связано со стерильностью.

Анализ различных комбинаций и этапов работы по получению живых размножающихся животных из консервированных клеток показывает, что все они осуществимы хотя бы на одном виде. Вместе с тем пока нет ни одного вида, для которого были бы выполнены все этапы. Следует однако заметить, что прогресс исследований в этой области идет очень быстро, и многие из задач, казавшихся ранее неосуществимыми, сейчас уже решены.

Для сохранения редких видов и генетических ресурсов на индивидуальном (втором) уровне организации жизни, то есть путем разведения в специальных питомниках и зоопарках, наибольший интерес представляют сравнительно простые ситуации, когда имеется консервированный генетический материал от обоих полов, но относящихся к животным, которые сохранились в резко ограниченном количестве и содержатся в удаленных друг от друга питомниках или зоопарках. Многие владельцы таких животных крайне неохотно дают их «взаймы», опасаясь (и не без оснований!) случайностей при транспортировке или при содержании в чужом «хранилище» (питомнике, зоопарке). Ведь в случае гибели вернуть аналогичное животное владельцу невозможно. При наличии консервированной спермы противоречие это решается исключительно просто и без всякого риска. Точно так же при наличии племенных книг криоконсервация спермы является абсолютно надежным препятствием против возникновения инбридинга в вольерных популяциях. Уже одно это делает создание криобанков генетического материала исключительно важным условием сохранения редких видов и существенным элементом общей стратегии сохранения генетических ресурсов Земли. Следует добавить, что в последние годы на базе криоконсервации спермы родился удивительно остроумный метод увеличения потомства у редких животных, которым свойственно приносить лишь по одному детенышу. Метод этот называется трансплантацией эмбрионов и основан на том, что самки таких видов продуцируют несколько яйцеклеток, из которых только одна оплодотворяется, а остальные после этого гибнут. Сущность метода трансплантации эмбриона теоретически проста: у находящейся в эструсе самки вымываются (в буквальном смысле слова!) все вышедшие из яичника яйцеклетки и изолированно помещаются в специальную среду. Сюда же добавляется капля размороженной спермы того же вида, и таким образом происходит искусственное оплодотворение яйцеклетки, которая после этого имплантируется (пересаживается) в матку самки другого, систематически близкого, но вовсе не редкого вида.

И удивительное дело, новорожденный оказывается полноценным потомком своих родителей, и не имеет никакого генетического сходства со своей кормилицей! Впервые такой эксперимент был успешно проведен в одном из американских зоопарков, когда обыкновенная корова благополучно выносила и родила теленка гаура, дикого быка из Юго-Восточной Азии, находящегося под угрозой исчезновения! А поскольку в процессе овуляции самка гаура производит до десятка яйцеклеток, то легко понять, насколько, перспективен этот метод разведения. Конечно, для такой операции нужна ювелирная техника и значительный опыт, но ведь результат - вот он, налицо.

То, что говорил Б.Н. Вепринцев в сентябре 1978 года в Ашхабаде, многим казалось плодом неуемной фантазии, фантастикой. Но вот прошло сравнительно немного времени - и грань между фантастикой и реальностью преодолена. Теперь есть все основания считать создание генетических криобанков необходимым и неотложным делом в цепи мероприятий, обеспечивающих сохранение генетических ресурсов нашей планеты, реальным шагом на пути спасения редких видов. Б.Н. Вепринцев считал даже, что в будущем возможно и восстановление исчезнувших видов. С этим утверждением пока сложно согласиться.