Выделение гликогена из печени

Принцип метода. Гликоген представляет собой белый порошок, хорошо растворяющийся в воде с образованием коллоидного раствора. Гликоген, подобно белкам, обладает резко выраженными гидрофильными свойствами, поэтому его можно легко осадить из растворов при высаливании солями щелочных и щелочно-земельных металлов, солями тяжелых металлов, спиртом. В печени человека при нормальном питании запасается 80-120 г гликогена. При голодании в течении суток почти весь запас гликогена расходуется и его не удается обнаружить обычными качественными реакциями. Метод основан на том, что гликоген хорошо растворим в воде и достаточно устойчив в слабокислой среде. Поэтому метод выделения гликогена сводится к механическому разрушению ткани и экстракции гликогена 5%-ным раствором ТХУ. Основная масса белков при процедуре денатурирует и их легко удалить из раствора фильтрованием.

Ход определения. 1. В опыте используют печень сытого и голодавшего животных. Печень забитых животных быстро извлекают, разрезают на тонкие пласты и немедленно опускают в стаканы с кипящим физиологическим раствором для инактивации фермента фосфорилазы гликогена, очень активно разрушающего гликоген. Через 10-15 минут печень извлекают из раствора. Дальнейшее исследование печени сытого и голодавшего животного проводится параллельно.

2. Отвешивают на весах 0,5 г печени, помещают в ступку, заливают 3 мл 5%-ного раствора ТХУ и растирают пестиком в течение 10 мин. Затем к экстракту прибавляют 3 мл дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.

3. С полученными фильтратами выполняют качественные реакции на гликоген

а) В одну пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, во вторую и третью пробирку – по 1 мл фильтратов. После этого в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли раствора Люголя и сравнивают окраску.

б) В три пробирки наливают по 10 капель фильтрата, полученного из печени сытого животного, и проделывают реакции осаждения. Для этого в первую пробирку приливают 10 капель этилового спирта, во вторую – 10 капель 10%-ного раствора ацетата свинца, в третью насыпают порошок сульфата аммония до полного насыщения (т.е. до тех пор, пока на дне пробирки останутся не растворяющиеся кристаллы соли). Наблюдают: выпадает ли осадок

Оформление работы. Внесите результаты в таблицу: сравните результаты, полученные с печенью сытого и голодавшего животного.

Форма записи