Векторні системи на основі Ті-плазмід

Грамнегативна грунтова бактерія Agrobakterium tumefaciens є фітопатогеном, який може трансформувати рослинні клітини і викликати утворення коронкових галів (наростів пухлинної тканини в місцях зараження). До цих бактерій чутливі дводольні рослини.

Вивчення Agrobakterium tumefaciens показало, що агентом, який викликає трансформацію клітин є плазміда. Всі властивості бактерій зумовлені наявністю в них Ті-плазмід. Ці плазміди представляють собою кільцеві молекули, що складають 3-5% від розміру хромосоми агробактерії (200 т.п.н.), мають сайт реплікації в А. tumefaciens і генетичний маркер – опін певного типу (амінокислота, синтез якої притаманний тільки агробактеріям з Ті-плазмідами).

Утворення коронкового галу починається з проникнення, інтеграції в геном рослинної клітини та експресії специфічної ділянки бактеріальної плазмідної ДНК, що називається трансформуюча ДНК, або Т-ДНК.

Т-ДНК містить дві фланкуючі послідовності: ліву і праву, які забезпечують інтеграцію Т-ДНК в рослинну хромосому; гени, кодуючі ферменти синтезу фітогормонів та ген, кодуючий синтез опіну. Поза межами Т-ДНК знаходиться ділянка необхідна для транспортування та інтеграції Т-ДНК (кластер генів vir), гени, що кодують катаболізм опінів та ділянка ori.

На основі Ті-плазмід створено дві векторні системи.

Бінарний клонуючий вектор (рис.6) містить ori для E.coli та А.tumefaciens, селективний маркерний ген для E.coli та A.tumefaciens (Amp або Kan), рослинний селективний ген (Марк.) та ген, експресії якого очікують, вбудовані в Т-ДНК. Бінарний вектор не містить генів vir, тому всі стадії клонування проводять в E.coli, після чого вводять в штам-реціпієнт A.tumefaciens, що несе модифіковану плазміду, яка містить повний набір генів vir, але з неї видалена частина або вся Т-ДНК. Ця плазміда допомагає переходу Т-ДНК з бінарного вектора в хромосомну ДНК рослини.

Коінтегративний клонуючий вектор (рис.7) містить сайт ініціації реплікації тільки для E.coli і не може самостійно існувати в A.tumefaciens. Він також містить селективний маркер, що використовується або в E.coli, або в A.tumefaciens (Amp або Kan), праву фланкуючу послідовність Т-ДНК (П), рослинний селективний маркер (Марк.), чужорідний ген та ділянку ДНК, гомологічну ділянці ДНК допоміжної Ті-плазміди (А1). Допоміжна неонкогенна Ті- плазміда містить ліву фланкуючу послідовність Т-ДНК (Л), гени vir та сайт ініціації реплікації для A.tumefaciens.

Коінтегративний вектор та неонкогенна плазміда містять гомологічні ділянки, що створюють сайт для гомологічної рекомбінації in vivo. Гомологічна рекомбінація коінтегративного клонуючого вектора з модифікованою Ті- плазмідою дає рекомбінантну плазміду, яка несе в собі клонований ген та рослинний маркерний ген, що фланковані правою та лівою кінцевими послідовностями Т-ДНК, а також містить гени vir, які необхідні для переносу Т-ДНК рослинну клітину - господаря.