Микроорганизмы как индикаторы

Характерной чертой современной науки является создание новых методов на стыках различных смежных областей науки. Примером служит развитие биологических методов анализа, базирующихся на достижениях таких областей биологии, как микробиология, зоология, ботаника, а также аналитической химии.

Биологические методы основаны на том, что для жизнедеятельности - роста, размножения и функционирования живых существ необходима среда строго определенного химического состава. При изменении этого состава, например при исключении из питательной среды какого-либо компонента или введении дополнительного (определяемого) соединения, организм через какое-то время, иногда практически сразу подает соответствующий ответный сигнал. Установление связи характера или интенсивности ответного сигнала организма (называемого индикаторным) с количеством введенного в среду или исключенного из среды компонента служит для его обнаружения или определения. Аналитическими индикаторами в биологических методах являются различные живые организмы, их органы и ткани, физиологические функции, биохимические реакции и т.д. Для биологических методов характерны своя методика эксперимента, аппаратура и способ регистрации ответного сигнала индикаторного организма.

Все вещества по отношению к живым организмам можно условно разделить на:

1) жизненно необходимые,

2) токсичные,

3) физиологически неактивные.

Очевидно, только в двух первых случаях можно ожидать сравнительно быструю ответную реакцию организма (аналитический сигнал). Физиологически неактивные вещества могут дать отдаленный результат, или их можно перевести в активное состояние в результате реакций взаимодействия с ингибиторами либо стимуляторами процессов жизнедеятельности организмов.

От характера определяемого вещества зависит выбор того или иного индикаторного организма. Его ответный сигнал на изменение химического состава твердой, жидкой или воздушной сред может быть самым разнообразным: изменение характера поведения (поведенческие реакции); стимуляция или подавление роста, накопления биомассы; изменение пигментации, состава крови, биоэлектрической активности органов и тканей; нарушение функций органов пищеварения, дыхания, размножения; патолого-анатомические изменения организма. Обобщенным показателем эффективности действия определяемого соединения на индикаторный организм является либо выживаемость, либо летальный исход. Все перечисленные или какие-либо другие изменения индикаторного организма в отдельности или в совокупности могут быть использованы в качестве аналитического сигнала, который можно измерить физико-химическим методом или оценить визуально.

Механизм взаимодействия определяемого химического соединения и индикаторного организма чрезвычайно сложен, это взаимодействие схематично можно представить следующей схемой:

Выбор способа регистрации ответного сигнала на заключительной стадии выполнения анализа зависит как от целей анализа, так и от механизма и степени взаимодействия определяемого вещества и индикаторного организма. Чем сложнее организм, тем большее число его жизненных функций можно использовать в качестве аналитических индикаторов, тем выше информативность биологических методов анализа. Ответный сигнал индикаторного организма на одно и то же вещество зависит от концентрации последнего: малые концентрации обычно стимулируют процессы жизнедеятельности организма, высокие угнетают. Существенное повышение концентрации биологически активного вещества приводит к летальному исходу.

Диапазон определяемых содержаний, предел обнаружения соединений зависят от физико-химических и биологических факторов: направленности и продолжительности воздействия химического соединения на организм; температуры, рН среды; уровня организации индикаторного организма, его индивидуальных, возрастных, половых особенностей.

В роли индикаторного организма могут выступать микроорганизмы, беспозвоночные, позвоночные. Применение этих индикаторных организмов в анализе мы и рассмотрим в статье. При этом следует отметить, что в последние годы все большее внимание ученых привлекают растительные индикаторы. Так, например, по скорости роста, увеличению массы, разветвленности корней растений можно оценить содержание в почве тяжелых металлов (свинца, кадмия).

Наиболее часто в качестве индикаторных организмов используют микроорганизмы: бактерии (рода Bacilus, Pseudomonas, Escherichia, стафилококки), актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи, водоросли. Микроорганизмы широко распространены в природе - они присутствуют в почве, водоемах, илах, воздухе; обладают высокой чувствительностью к действию биологически активных веществ; просты в культивировании и хранении; длительное время сохраняют свои свойства в виде лиофилизированных препаратов.

Методы определения веществ с использованием микроорганизмов предполагают культивирование чистых индикаторных культур на плотных или жидких питательных средах при постоянных условиях (температуре, рН, воздухообмене, влажности), а также учет фаз их роста, зависящих от физиологического состояния клетки.

Изменение химического состава питательной среды приводит к подавлению или стимуляции роста как отдельной клетки микроорганизма, так и популяции в целом, и сопоставление наблюдаемого отклика организма с контрольным опытом, проводимым в постоянной по составу питательной среде, является основой биологического метода анализа.

На плотных питательных средах регистрируют изменения внешнего вида колоний, их размеров и формы, характерной для каждого вида микроорганизмов. Методы определения биологически активных веществ при этом основаны на диффузии их в агаризованную среду с образованием зон угнетения или стимуляции роста. Диаметр этих зон является линейной функцией концентрации определяемых веществ в некотором ее интервале. При постоянном составе среды, оптимальных для данного организма рН и температуре величина зон зависит от толщины питательного слоя: чем толще слой, тем меньше зона. Для анализа микробиологических систем возможно использование явления дифракции света на микроорганизмах.

Характер роста культуры в жидких питательных средах, содержащих все необходимые компоненты, более однообразен, чем на поверхности твердых питательных сред. В зависимости от количества определяемого компонента, введенного в прозрачную питательную среду, изменяется помутнение культурального раствора по сравнению с контрольным раствором: при подавлении роста культуры интенсивность помутнения нарастает медленно, при стимулирующем действии определяемого вещества либо иона анализируемый раствор мутнеет значительно быстрее контрольного. По данным нефелометрических (фотометрических) измерений строят градуировочный график зависимости интенсивности изменения оптической плотности исследуемого раствора от концентрации определяемого вещества, с помощью которого и получают результаты анализа. Продолжительность анализа с использованием быстро растущих культур составляет не менее 3,5-4 ч. В зависимости от характера среды интенсивность роста (размножения, угнетения) популяций оценивают оптическими, диффузионными или электрохимическими методами.

При выборе индикаторной культуры для решения конкретной аналитической задачи следует принимать во внимание пищевые потребности организмов. Так, например, автотрофные микроорганизмы питаются в основном неорганическими солями и не нуждаются в органических соединениях. Для питания гетеротрофных бактерий, дрожжевых культур, плесневых грибов необходимы органические вещества.

К широко используемым в неорганическом анализе микроорганизмам относятся плесневые грибы рода Aspergillus. Наибольшим токсическим действием на эти культуры обладают нитраты ртути (II), кадмия, таллия, что объясняется блокированием ими SH-групп молекул белка микроорганизмов. Из анионов наиболее токсичными для исследованных грибов являются и в концентрациях 1,0 и 0,1 мМ соответственно.

Грибы как аналитические индикаторы широко используют при анализе почв на содержание (на уровне 1 пг/мл - 10 нг/мл) биогенных элементов минерального питания высших растений, например цинка, меди, марганца, железа, молибдена. Возможно также определять в почвах усвояемые формы калия, фосфора, углерода, азота, серы. При этом учитывают то, что эффективности физиологического воздействия различных элементов на растения и микроорганизмы принципиально не различаются. Микробиологические методы анализа в данном случае часто оказываются более информативными, чем химические, так как позволяют определять не валовое содержание элементов, а их физиологически активные формы, влияющие на жизнедеятельность растений. Это позволяет наиболее полно характеризовать плодородие почв.

Ростовые реакции микроорганизмов, изменяющиеся под действием различных химических соединений, применяют в анализе природных и сточных вод. С использованием бактерий и дрожжей разработан диффузионный метод обнаружения в сточных водах фенолов, нефтепродуктов, фосфор- и элементоорганических соединений. Иллюстрацией возможностей применения микроорганизмов в аналитических целях является схема 1.

Чрезвычайно высокой чувствительностью определения некоторых биологически активных соединений отличается биолюминесцентный метод, основанный на реакции окисления кислородом воздуха субстрата люциферина, катализируемой ферментами люциферазами, выделенными из различных видов морских светящихся бактерий Photobacterium, Beneckea или жуков-светляков. Наряду с люциферином и люциферазой для протекания указанной реакции необходима аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая участвует в многочисленных метаболических реакциях в организме, являясь аккумулятором энергии и ее источником для самых разных процессов, протекающих в живой клетке. Содержание АТФ в тканях, растительных и живых клетках свидетельствует об энергетическом состоянии клеток. При угнетающем или стимулирующем действии каких-либо веществ на рост микроорганизмов содержание АТФ в них соответственно понижается или повышается. Специфичность действия люциферазы светляков по отношению к АТФ, высокий квантовый выход реакции позволили создать на этой основе высокочувствительные (с пределами обнаружения 10-17-10-15 М) и селективные методы определения АТФ, а также различных метаболитов, в процессе превращения которых образуется АТФ. Биолюминесцентный метод определения содержания АТФ в живых (растущих или гибнущих) клетках используют для экспресс-определения антибиотиков в крови, микробных бактерий в моче, для изучения повреждения клеточных мембран и других биохимических анализах и исследованиях.

Микроорганизмы широко применяют при изучении антибиотической активности веществ, их биологической роли, контроле технологических процессов промышленного производства антибиотиков, витаминов и аминокислот. Следует отметить еще один важный аспект применения микроорганизмов в химическом анализе-концентрирование и выделение микроэлементов из разбавленных растворов. Потребляя и усваивая микроэлементы в процессе жизнедеятельности, микроорганизмы могут селективно накапливать некоторые из них в своих клетках, очищая при этом питательные растворы от примесей. Например, плесневые грибы применяют для избирательного осаждения золота из хлоридных растворов, очистки растворов от ионов меди, цинка, железа.