Реакции иммунного лизиса. Ингредиенты. Механизм. Практическое применение

Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.

 

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

 

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

 

Реакция связывания комплемента (РСК).

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения антигена в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Комплемент связывается с Fc-фрагментом антител независимо от их специфичности. Способность комплемента связываться только с комплексом антиген — антитело за счет Fc-фрагментов последнего и не вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия. Комплемент= используют сыворотку крови морской свинки с установкой рабочей дозы. В пробирку вносят сыворотку крови, АГ и рабочую дозу комплемента. Инкубируют. Регистрация-по гемолизу эритроцитов барана. Когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген — антитело, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой антиген — антитело, т.е. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкрестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++.

Для реакции необходимы:

5. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

6. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

7. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок.

8. Изотонический раствор.

И 30. Реакции агглютинации и преципитации. Механизм, ингридиенты, варианты постановки. Практическое применение. Монорецепторные агглютинирующие сыворотки.

Реакция агглютинации - внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом.

Реакция протекает в две фазы.

2. В первой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены,

3. Во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

Избыток или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов).

Варианты:

ñ пластинчатая (только адсорбированные сыворотки)

ñ развернутая (разведения, исследуют кол-во АТ, титр):

5. для выявления АТ=имм сыв+корп АГ(диагностикум), экспресс-диагностика (кровяно-капельная при туляремии, на стекле)

6. идентификация культуры возбудителец (имм диагностические агглютинирующие сыв).

Бывают непрямые (пассивные) РА=адсорбированные АГ и АТ на корпускулярном носителе (латекс, бетонит, актив уголь), клетки.

Бывает ко-агглютинация=для идентификации возб. Необх ко-агглютинирующие реагенты=взвесь золотистых стафилококков, на А белке кот нагружены Fc-фрагмент Ат к искомым АГ-на стекле капельным методом. Характер и скорость реакции зависят от антигенного строения бактериальной клетки. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции антител по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител.

           Полученные сыворотки называются монорецепторными, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара. Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РПА). Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках или частицах. В качестве сорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т.е. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела.

 

Реакция преципитации и ее варианты - это агрегация антителами (преципитинами) растворимых АГ (преципитиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жидкости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д. Таким образом, в отличие от реакции агглютинации, антиген для реакции преципитации обязательно должен быть в молекулярном виде.

           Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агглютинации, т.е. по «теории решетки». Осаждение из раствора комплексов АГ-АТ происходит в диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаимодействующих молекул. В случае большого избытка одного из реагентов образуется растворимый комплекс АГ-АТ и феномен реакции не проявляется. Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких частичек АГ с образованием видимого преципитата необходимо значительно большее количество АТ. Поэтому диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром АТ. Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твердой среде.

 

Реакция преципитации в жидкой среде. Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации.

 

Реакция преципитации в агаре (геле). Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар-агара. Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата. Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

 

Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга (4 – 10 мм) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями. В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях.

           Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях. Для количественного определения антигена часто используют простую радиальную иммунодиффузию по Манчини, которая основана на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении раствора исследуемого АГ в лунки, вырезанные в слое геля, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого АГ. 

 

ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл. Первая пробирка, где появились хлопья (инициальная флоккуляция) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной  флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт стандартных препаратов.

РП применяются:

3. для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и животных

4. для изучения токсигенности бактерий;

5. при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактери-альной, вирусной, грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.);

6. для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных – определяют общий АГ;

7. в судебно-медицинской практике – для определения видовой принадлежности белков (крови, слюны, спермы и т.д.);

8. для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях