Хранение и область применения

Использование клетки хозяина для хранения вектора позволяет легко амплифициривать и находить определённые клоны из библиотеки для анализа. Геномную библиотеку можно хранить длительно (в замороженном состоянии). При необходимости отдельные бактериальные или дрожжевые клоны, содержащие фрагменты ДНК с нужными генами или другими элементами генома, выделяют и размножают (клонируют). Клонированные таким способом участки генома выделяют из клеток и используют для решения различных теоретических и практических задач генетики, медицины (в том числе диагностики наследственных болезней) и биотехнологии, а также для картирования геномов^.

Скрининг библиотеки, то есть поиск конкретного фрагмента ДНК среди сотен и тысяч других последовательностей, осуществляют методом ДНК-гибридизации при помощи ДНК-зондов . Если исследователь знает хотя бы небольшую последовательность нуклеотидов с искомого участка, он искусственно синтезирует комплементарную последовательность (праймер длиной около 20 нуклеотидов) и метит её или радиоактивным изотопом, или флуоресцентной меткой. С чашки Петри с колониями посредством блоттинга делают реплику: прикладывают к чашке тонкую нитроцеллюлозную или иную мембрану, на которой остаётся отпечаток всех колоний. После этого осуществляют разрушение бактериальных клеток на отпечатке, освобождение ДНК от белков в щелочной среде и денатурацию ДНК до одноцепочечной молекулы. Далее обрабатывают все колонии зондом и смотрят, в какой из колоний зонд присоединился по принципу комплементарности. Эта колония и будет содержать нужный фрагмент ДНК.

Иногда исследователь не знает последовательности ДНК, которую ищет, но имеет последовательность аминокислот исследуемого белка. Поскольку каждой аминокислоте может соответствовать несколько триплетов нуклеотидов (от одного до шести), то и вероятные кодирующие ДНК могут быть разными. Тогда готовится смесь зондов, которые могут распознать предполагаемую последовательность.

Для создания банка генов необходимо:

1) Выделение всей геномной ДНК

2) Фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком

3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК.

4) рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.

5) Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.

Достоинства: библиотека генов может храниться и использваться неограниченно долго

Недостатки: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

 

Использование:

-источник трансгенов

-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков

- сохранение генофонда исчезающих видов.

 

9. Охарактеризуйте векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК; объясните, в каких случаях они используются.

 

Преимущества использования крупных фрагментов ДНК для клонирования:

- суще­ственно облегчается создание геномных библиотек

- удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов

- Векторы на основе бактериофага ƛ

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага К Е. coli. После проникновения фага X в клетку Е. coli

• Лямбда фаг — умеренный бактериофаг с двухцепочечной геномной ДНК размером 45 тыс. п.н., размножающийся в клетках E. coli; в зависимости от характера взаимодействия вируса и клетки-хозяина развитие Лямбда фага может происходить по литическому или по лизогенному пути. Размер ДНК фага ƛ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК.

• После проникновения фага X в клетку Е. coli события могут развиваться по двум сценариям.

• Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизирует) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. 

• При альтернативном варианте развития событий фаговая ДНК включается в хромосому Е. coli как профаг и

• реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами (состояние лизогении).

• Однако при недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литический цикл развития.

• Литический цикл развития:

•  Инфекционная фаговая частица имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки и отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага ƛ — это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в Е. coli, cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. (рис. А).

• Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица (рис.Б). При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т. п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.

 При репликации кольцевой ДНК бактериофага ƛ образуется линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т. п. н. Каждый из этих сегментов представляет собой полноразмерную фаговую ДНК. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток

 

10. Опишите способы оптимизации экспрессии клонированных генов в клетках прокариот.

Основная цель экспериментов по клонированию генов в составе рекомбинантных ДНК, которые предполагается использовать в биотехнологии, – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Для этой цели в биотехнологии используют специализированные векторы – экспрессионные (рис. 54) и соответствующие клетки-реципиенты.

Способность к экспрессии – одно из самых важных свойств гена. За это свойство отвечают различные генетические элементы (последовательности нуклеотидов), которые необходимо встроить в векторную молекулу, несущую ген. Такие последовательности нуклеотидов принято называть регуляторными. Напомним, что к ним относятся последовательности, которые регулируют прочность и точность связывания с молекулой ДНК-матрицы фермента РНК-полимеразы, а также последовательности, сигнализирующие об окончании процесса транскрипции (промотор и терминатор соответственно). Кроме того, синтезируемая в процессе транскрипции мРНК должна содержать в своей структуре последовательности, которые обеспечат ее точное связывание с малой субъединицей рибосомы, тем самым, гарантируя правильную трансляцию. А это требует введения в структуру рекомбинантной ДНК участков, которые получили название сайты связывания рибосом (rbs – ribosome bind site). Упомянутые структурные элементы ДНК обеспечивают также и достаточную копийность как мРНК, так и синтезируемых полипептидов. Также при конструировании экспрессирующихся рекомбинантных ДНК необходимо предусмотреть место в клетке, где будет осуществляться экспрессия вводимых последовательностей ДНК: в цитоплазме в составе плазмидной ДНК или после интеграции в хромосомную ДНК хозяина. Кроме того, в структуре рекомбинантной ДНК должна содержаться информация и о месте локализации в клетке синтезируемого конечного продукта, т.е. белка. Однако, понятие системы экспрессии включает в себя не только структурные модули экспрессирующихся рекомбинантных ДНК, но и особенные характеристики клеток-хозяев, где планируется осуществлять экспрессию. В данном разделе будут рассмотрены некоторые общие моменты, которые необходимо учитывать при выборе системы экспрессии.

 

 

Следует отметить, что никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. В то же время, можно выделить наиболее важные свойства систем экспрессии:

1. Тип промотора и терминатора транскрипции.

 2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.

3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки).

4. Конечная локализация синтезируемого продукта.

5. Эффективность трансляции в организме хозяина.

6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.

В исследовательской работе, а также для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E.coli. Это связано с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.

При рассмотрении генетических векторов для клонирования ДНК (см. раздел векторы) мы познакомились с семейством векторов pUC, в состав которых входят некоторые модули системы α-комплементации лактозного оперона E.coli. Эти регуляторные элементы транскрипции Lac- оперона дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе, обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.

11. Объясните, в чем преимущество стратегии синтеза белка-мишени в составе химерного продукта; опишите, как создают химерный белок.

Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. В самом простом виде векторная система слияния предусматривает включение гена-мишени или его сегмента в кодирующий участок клонированного гена-хозяина.

Если при объединении сегментов ДНК происходит изменение рамки считывания, т. е. последовательность кодонов детерминирует укороченный или неправильный трансляционный продукт, то не сможет образоваться и функционально активная форма белка, и не только!

Расщепление химерных белков: Можно писать про инсулин: сначала синтезируют химерный белок (проинсулин) далее убирают С-цепь, тем самым активируют его à инсулин (если его сразу синтезировать без С-цепи, то будет нестабильным!)