Опишите генноинженерный способ утилизации целлюлозы

 Структурный каркас почти всех наземных растений состоит из полимеров: лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы. Объединяясь в разных пропорциях, они образуют лигноцеллюлозный материал, на долю которого приходится основная часть биомассы, остающейся в огромном количестве в виде отходов сельского хозяйства, деревообрабатывающей промышленности и других отраслей хозяйственной деятельности человека. Эти отходы необходимо переработать или использовать в качестве промышленного сырья. С этой точки зрения лигноцеллюлозные материалы можно разделить на три класса:

• Сами растения, специально выращиваемые для получения целлюлозы, строительных материалов или корма для скота (хлопок, древесина, сено).

• Растительные отходы, остающиеся после сбора и переработки урожая и после обработки древесины (солома, рисовая шелуха, багасса сахарного тростника, древесная шепа, опилки и т. д.).

• Бытовые отходы (использованные бумага, картон и т. д.).     

Целлюлоза, наиболее простой компонент лигноцеллюлозы, является самым распространенным природным полимером. Его длинные цепи состоят из остатков D-глюкозы. соединенных р-1,4-связями. При гидролизе из целлюлозы, как и из крахмала, образуется глюкоза, но сами эти исходные вещества имеют разное строение. В целлюлозе полимерные цепи упакованы так, что образуется кристаллоподобная структура, непроницаемая для воды; поэтому целлюлоза не растворяется в воде и устойчива к гидролизу. Целлюлоза — очень ценный материал, из которого можно получать множество продуктов (например, этанол). Но сначала необходимо высвободить ее из комплекса с лигнином и гемицеллюлозой. Для этого можно обработать лигноцеллюлозный материал сильной кислотой или сильной щелочью либо подвергнуть его действию высоких температуры и давления. В лю бом случае необходимые для этого энергетические затраты существенно повысят стоимость конечного продукта. Годовое производство лигноцеллюлозы огромно, поэтому ведется непрерывный поиск более эффективных способов ферментативного расщепления целлюлозы (и, в меньшей степени, гемицеллюлозы). Кроме того, разрабатываются методы избирательного химического и ферментативного расшепления лигнина.

Выделение прокариотических целлюлозных генов

Многие бактерии и грибы способны расщеплять целлюлозу благодаря совместному действию нескольких ферментов, называемых целлюлазами. У некоторых микроорганизмов они входят в состав цедлюдосомы — белкового комплекса, находящегося на клеточной поверхности.

Расщепление целлюлозы с помощью целлюлолитических микроорганизмов происходит медленно и часто не до конца. Поэтому были предприняты попытки создать с помощью генной инженерии микроорганизмы, обладающие более высокой целлюлазной активностью. Для этого выделили про- и эукариотические гены, кодирующие отдельные ферменты целлюлазного комплекса. Прокариотические эндоглюканазные гены клонировали и идентифицировали с помощью следующего простого, но эффективного подхода.

1. Клонированием в Е. coli создали банк ДНКклонов целлюлолитического прокариотического организма и вырашивали рекомбинантные клетки в течение 12 ч на твердой среде, содержащей селективный антибиотик.

2. Образовавшиеся колонии покрыли слоем агара, содержащего карбоксиметилцеллюлозу (КМК), растворимое производное целлюлозы, и инкубировали при 37 "С еще несколько часов. За это время произошло частичное расщепление молекул КМК, находящихся вблизи колоний, которые синтезируют и секретируют эндоглюканазу. Трансформированные клетки, синтезирующие, но не секретирующие эндоглюканазу, не способны расщеплять данный субстрат, молекулы которого из-за большого размера не проникают в клетку.

3. Те области, где произошел гидролиз КМК, выявляли с помощью не токсичного для бактерий красителя конго красного и раствора хлорида натрия. Конго красный избирательно связывается с целлюлозой, окрашивая ее в красный цвет, и слабо связывается с низкомолекулярными сахаридами, окрашивая их в желтоватый цвет. Обработка хлоридом натрия стабилизирует цвет. Колонии, продуцирующие секретируемую эндоглюканазу, были окружены желтым гало, а фон, создаваемый нерасщепленной КМК, имел красный цвет.

С помощью этого подхода были выделены гены эндоглюканазы из Streptomyces, Clostridium, Thermoanaerobacter, Thermomonospora, Erwinia, Pseudomonas, Cellvibrio, Ruminococcus, Cellulomonas, Fibrobacter и Bacillus. Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител; секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизировали in situ (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. Прокариотические (3-глюкозидазные гены выделяли с помощью трансформации Е. coli банком ДНК-клонов, полученным из продуцирующего данный фермент микроорганизма, и отбора трансформантов, способных расти на минимальной среде с целлобиозой в качестве единственного источника углерода. Клоны, проявляющие (3-глюкозидазную активность, можно также выявлять с помощью среды, содержащей хромо генный субстрат (например, 5бром-4-хлор-3-индол-(3-0-глюкопиранозид), или целлобиозного агара Мак-Конки; в этих условиях колонии окрашиваются в красный цвет.

Выделение эукариотических целлюлозных генов

Скрининг кДНК- или геномных библиотек с помощью гибридизации с гетерологичным зондом не очень эффективен при идентификации целлюлазных генов, поскольку их нуклеотидные последовательности довольно сильно различаются у разных организмов. Поэтому нужны новые подходы для выделения мРНК целлюлолитических ферментов из грибов или растений. К сожалению, эти мРНК составляют лишь небольшую часть суммарной мРНК, поэтому приходится обогащать библиотеки этими мРНК или кДНК и элиминировать кДНК-клоны, не несушие последовательности-мишени. Для выделения некоторых генов эукариотических целлюлаз использовали метод «дифференциальной гибридизации», суть которого состоит в следующем:

1. Выделяют мРНК из клеток, выращенных на среде без целлюлозы (неиндуцированных клеток), и клеток, которые для увеличения продукции целлюлаз были выращены в присутствии целлюлозы или ее производных (индуцированных клеток).

2. Каждую популяцию мРНК фракционируют в градиенте плотности сахарозы. Проводят трансляцию мРНК каждой фракции в бесклеточной системе на основе ретикулоцитов кролика или зародышей пшеницы. Определяют мол. массу соответствующих белков и проводят иммунологический тест, с тем чтобы идентифицировать фракцию (или фракции), содержащую мРНК целлюлазы. Разделяют продукты трансляции в полиакриламидном геле и выявляют полосы, происходящие от индуцированных клеток и отсутствующие для неиндуцированных; материал этих полос и представляет собой белки, синтез которых был индуцирован целлюлозой.

3. мРНК-фракции индуцированных клеток, детерминирующие синтез целлюлаз, и их «партнеры» в градиенте плотности сахарозы мРНК неиндуцированных клеток по отдельности используют в качестве матриц для синтеза кДНК.

4. кДНК индуцированных клеток клонируют в плазмидном или фаговом векторе, вводят в Е. coli, высевают на чашки, делают реплики и проводят скрининг, используя в качестве гибридизационных зондов радиоактивно меченную кДНК фракций из индуцированных и неиндуцированных клеток. Клоны, гибридизующиеся с кДНК индуцированных и не гибридизующиеся с кДНК неиндуцированных клеток, могут содержать целлюлазные гены, поэтому проводят их дальнейшее изучение.

5. Чтобы доказать, что позитивные кДНК-клоны действительно кодируют целлюлазы, их ДНК гибридизуют с суммарной мРНК индуцированных клеток, проводят трансляцию гибридизовавшейся мРНК in vitro в бесклеточной системе и идентифицируют полученные продукты с помощью антител, специфичных к ферментам целлюлазного комплекса.

6. Определяют нуклеотидную последовательность каждого позитивного кДНК-клона и устанавливают, какие клоны кодируют одинаковые, а какие — разные белки целлюлазного комплекса.

Манипуляции с целлюлозными генами

Клонированные целлюлазные гены можно использовать в разных целях: для облегчения очистки рекомбинантных белков с помощью связывающего целлюлозу домена; для получения коммерческих продуктов (например, этанола) из целлюлозных отходов с помощью микроорганизмов, в которые встроены целлюлазные гены.

• Чтобы очистить полученный белок, его экстракт пропускают через колонку, набитую целлюлозой. С целлюлозой связывается только гибридный белок; его элюируют и удаляют «целлюлозный» домен протеолизом. Эта система сходна с иммуноаффинной хроматографией, но обходится дешевле.

• Большинство целлюлазных генов исходно клонировали и экспрессировали в Е. coli, но их можно ввести в другие микроорганизмы и получить новые штаммы с полезными свойствами. Так, S. cerevisiae и Z. mobilis, эффективно преобразующие в этанол простые сахара (например, глюкозу) после введения им целлюлазных генов, могли бы превращать целлюлозу непосредственно в этанол.

• Если ввести ген эндоглюканазы, находящийся под контролем конститутивного промотора актинового гена дрожжей, в винные дрожжи, можно усилить аромат получаемого вина. Это связано с повышением содержания в нем как минимум 12 летучих соединений, в том числе этилпропионата, 2-бутанола, изоамилацетата, изоамилонового спирта и изомасляной кислоты. С помощью такой генетической модификации можно стабилизировать процесс ферментации и создать такие штаммы дрожжей, которые будут производить вина с определенными свойствами.

• Исследовалась также возможность использования целлюлаз при промышленной биопереработке бумажных отходов в этанол. Для этого отходы частично расщепляли целлюлазами при 45 "С, а затем, не удаляя целлюлаз, проводили ферментацию высвободившейся глюкозы с помощью S. cerevisiae при 37 °С. Основываясь на полученных результатах, рассчитали, что этот подход позволит получить 400 л этанола из 1 т бумажных отходов. Если все 100 млн. т бумажных отходов, ежегодно образующихся в Северной Америке, превратить в этанол и использовать его в качестве топлива, можно сэкономить примерно 16% бензина.