2020-01-14
350
На практике иитерферон-α выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят вирус — интерфероноген (вирус Сендай или вирус ньюкаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус — интерфероноген инактивируют любым из приемлемых способов. Супернатант (от лат. supernatans — плавающий на поверхности), или надосадок представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Это — пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и друтой интерфероны должны быть стерилъными.
|
|
|
Активность препаратов определяют титрованием на первичных культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная активность (так называемая удельная активность) нативного интерферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного — 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к высоко эффективной жидкостной хроматографии.
Интерферрн р получают из фибробластов, выращенных в монослойной культуре, индуцированной полиИ: полиЦ в присутствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой культуральной жидкости) и, к тому же, после 48—72 часов клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически—мало выгодных.
В молекуле интерферона имеются два консервативных домена — один локализуется на NH 2-конце, а другой — на СООН-конце. Первый, очевидно, помогает связыванию с рецептором на повер-хности клетки, а второй — моделирует это связывание и опосредует другие биологические функции.
Интерфероны α, β, и у иммунологически различны и, например, α-антисыворотка не инактивирует гетерологичные интерфероны.
Интерфероны обладают двумя типами биологической активности — противовирусной и противоклеточной, В отношении вирусов действие трех интерферонов сравнимое по эффективности, но в отношении клеток более активен интерферон у, причем против опухолевых клеток он активнее, нежели против нормальных кле-ток.
|
|
|
Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.
В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.
Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.
Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.
На практике интерфероны применяют при вирусных инфекциях, ревматоидном артрите (интерферон, при иммунопатологии и в онкологии).
| 49. Обоснуйте возможность применения интерферонов при онкологических заболеваниях В последние годы стали широко использовать для лечения различных онкологических заболеваний интерферон-а (ИФН-а). Противоопухолевый эффект ИФН связан с их способностью замедлять или подавлять рост культуры клеток и активировать противоопухолевые механизмы иммунной системы. Все противоопухолевые эффекты ИФН делятся на прямые и непрямые. Прямые связаны со способностью оказывать непосредственное воздействие на опухолевые клетки – их рост и дифференцировку, непрямые – с усилением способности иммунокомпетентных клеток обнаруживать и уничтожать атипичные клетки организма. ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ В настоящее время существует широкий спектр препаратов различных типов и подтипов ИФН, различающихся по способу получения (природные и рекомбинантные) и по форме выпуска: для интраназального применения, инъекций, ингаляционного применения, мазь, суппозитории. Основные области применения ИФН – это хронический миелолейкоз, Т-клеточная лимфома кожи, множественная миелома, злокачественная меланома и рак почки. Одной из опухолей, характеризующихся относительной устойчивостью к химиотерапии, является рак почки. Рекомбинантные ИФН были внедрены в клинику в начале 1980-х годов. Примерно у 15% пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком установлен положительный ответ на лечение ИФН, при этом полная ремиссия достигается редко. Известно, что при использовании ИФН-а в высоких дозах преобладают его противоопухолевые и антипролиферативные эффекты, а в низких дозах - иммуномодулирующие. Препараты: Вэлферон (рак почки, меланома); Ребиф (рак шейки матки); Иногда терапия активирует иммунные клетки чрезмерно, и они начинают атаковать нормальные ткани организма. Из-за этого могут возникать некоторые побочные эффекты: Кожные реакции: покраснение, отечность, сухость, повышение чувствительности к свету, трещины на кончиках пальцев. Симптомы, напоминающие грипп: слабость, разбитость, повышенная температура, озноб, кашель. Тошнота и рвота. Головные боли, головокружения. Повышение или снижение артериального давления. Мышечные боли. Одышка. Отеки на ногах. Увеличение веса из-за задержки жидкости в организме. Диарея. | |||||||
| 50. Обоснуйте возможность применения интерферонов при вирусных заболеваниях
ИФН 1-го типа обладают выраженным антивирусным действием, блокируя синтез вирусных белков и подавляя другие этапы их репродукции, а ИФН 2-го типа активно воздействует на иммуноциты (NK-клетки, Т-лимфоциты, моноциты, макрофаги и гранулоциты). При заражении клетки вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин одновременно с этим начинает продукцию интерферона, который выходит из клетки и вступает в контакт с соседними клетками. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению. Интерферон действует в нескольких направлениях. Во-первых, он оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них цепь событий, приводящих к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях сборки и выхода вирусных частиц. Также, интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка p53, что ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и активирует иммунопротеасому. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости I класса обеспечивает эффективную презентацию вирусных пептидов цитотоксическим Т-лимфоцитам и натуральным киллерам, а иммунопротеасома осуществляет процессинг вирусных пептидов, предшествующий презентации. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам. Т-хелперы, в свою очередь, выделяют цитокины, которые координируют активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов, например интерферон-γ, могут прямо стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Препараты доступны в виде спреев (назальные), таблеток, ректальных свечей, в виде инъекций.
Анаферон, Виферон, Гриппферон | |||||||
| 51. Охарактеризуйте штаммы микроорганизмов, обладающих способностью к трансформации стероидов Биотрансформация- заключается в превращении метаболитов в структурно родственные соединения, обладающие более ценными свойствами, чем исходные вещества, под действием микробных клеток. Поскольку микроорганизмы могут проявлять свое каталитическое действие в отношении лишь каких-то определенных веществ, протекающие при их участии процессы более специфичны, чем чисто химические. Для промышленного получения стероидных гормонов применяют метод микробиологической трансформации. Биотрансформация молекулы стероидных веществ-это изменение структуры молекул стероида с участием ферментов микроорганизма и в результате получения вещества с новыми фармакологическими свойствами. Реакции микробиологической трансформации молекул стероида, которые применяются в промышленности заключается в получении: прогестерона, преднизолона и гидроксикортизона. Для получения гидрокортизона, кортизона и преднизолона методом микробиологической трансформации в качестве предшественника применяют вещество S Рейхтейн, краткое его называют S вещество. Данное вещество полученное с помощью Corynebacterium mediolanum.
Получение гидрокортизона (кортизола) С помощью Curvularia lunata из вещества S включает следующие стадии: культуру Curvularia lunata, которую применяют для биотрансформации, выращивают в стерильных условиях. В состав среды культивирования входит: сахароза, гидролизат дрожжей и сложная смесь неорганических солей. Из кульптуры с помощью сепаратора выделяют мицелий, затем водную суспензию мицелия помещают в ферментер. - Реакцию биотрансформации проводят в стерилизованном формалином ферментере. Суспензию стероида, концентрация 1 г/л, вносят в ферментер, добавляют антибиотик для ингибирования чужой микрофлоры и проводят ферментацию.
· Мицелий выделяют, с помощью экстракции -сепарации промывают органическими растворителями, затем из водной среды выделяют продукт трансформации гидрокортизон.
Превращение гидрокортизона в преднизолон. Гидрокортизон микробиологической дигидрогенизацией превращают в преднизолон. Дегидрогенизация кортизола осуществляется с помощью клеток культуры бактерий Arthrobacter simplex. При проведении биотрансформации в состав среды культивирования входят: пептон, глюкоза и экстракт кукурузы. В среду через сутки добавляют S вещество. B течение всего процесса биотрансформации-120 часов, поддерживается нейтральный pH среды, температура 28 градусов C. При соблюдении указанных условий выход преднизолона достигает 93%.
Стоимость преднизолона полученного методом биотрансформации в промышленном масштабе снизилось в 200 раз | |||||||
| 52. Опишите перспективы и способы биотехнологического производства интерлейкинов Освоен выпуск двух рекомбинантных интерлейкинов: Беталейкина (E.coli) и Ронколейкина (Saccharomycescerevisiae) В одном из способов получения рекомбинантного ИЛ-2 в качестве продуцента используют E.coli (кишечную палочку). Кишечная палочка представляет собой условно-патогенную флору. Поэтому препараты ИЛ-2 из E.coli требуют тщательной очистки и могут быть токсичными. Дрожжевые клетки являются более привлекательными продуцентами гетерологичного ИЛ-2. Основные этапы: выращивания клеток штамма на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата; центрифугирование или фильтрование, концентрирования интерлейкина-2; разрушение клеток (в случае использования дрожжей), очистки интерлейкина-2 (например хроматографией на смоле с обращенной фазой), лиофильное высушивание интерлейкина-2 в присутствии маннитола, оценка биологической активности. Компонент среды Гистидин, HCl, (NH4)2SO4, MgSO4×7H2O, NaCl, CaCl2×2H2O, KH2PO4, Глюкоза, H3BO3, CuSO4×5H2O, KI, FeCl3×6H2O, MnSO4, NaMoO4×2H2O, ZnSO4×7H2O, Биотин, Кальция пантотенат, Фолиевая кислота, Инозит, Никотиновая кислота, П-аминобензойная кислота, Пиридоксина гидрохлорид, Рибофлавин, Тиамина гидрохлорид Чаще всего используют температуру от 25°C до 34°C, предпочтительно от 28°C до 32°C, наиболее предпочтительно 30°. Скорость вращения мешалки может составлять от 100 до 400 об/мин, предпочтительно, 200 об/мин. По окончании культивирования клетки отделяют от культуральной среды с помощью, например, центрифугирования или фильтрования, что является общеизвестными операциями при работе с культурами дрожжей. Так получают осадок дрожжевых клеток. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают. Полученную биомассу можно использовать сразу или подвергнуть заморозке для хранения с целью в дальнейшем использовать в способе по изобретению. - Разрушение дрожжевых клеток осуществляют любыми известными способами, представляющими собой механическое разрушение, в частности, с использованием высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками. - Очистку от примесных дрожжевых липидов и белков начинают с центрифугирования суспензии, полученной после механического разрушения дрожжевых клеток -Оценку биологической активности полученного препарата ИЛ-2 можно провести в международном стандартном тесте с культурой ИЛ-2-зависимых опухолеспецифических цитотоксических T-лимфоцитов мыши | |||||||
| 53. Представьте схему создания моноклонального антитела против иммуноглобулинов Е человека для лечения аллергических заболеваний Технологическая схема производства моноклональных антител может быть представлена следующим образом:
Она включает два этапа – лабораторный, результатом которого является подготовка инокулята, и цеховой, результатом которого является непосредственно получение готового продукта. Процесс иммунизации проводится с целью формирования иммунного ответа и запуска выраженного антителообразования. Параллельно с этим происходит культивирование миеломы. Клетки миеломы – это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, которые способны синтезировать моноклональные антитела определенной специфичности и обладают способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro. Скрининг гибридов-продуцентов. Наиболее распространенными методами являются методы иммуноанализа на основе ферментных и флуоресцентных меток. После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие антитела, приступают к их массовому наращиванию, результатом чего является подготовка инокулята.
МКА связывается с IgE и предотвращает его взаимодействие с высокоаффинным рецептором, при этом происходит снижение количества свободного IgE, который является пусковым фактором для каскада аллергических реакций. На сегодняшний день известны препараты: Ксолар, Омализумаб | |||||||
|
54. Представьте схему создания рекомбинантных антигенов Рекомбинантные антигены - синтезированный в клетках E.coli рекомбинантный белок, содержащий фрагмент белка возбудителя различных заболеваний. 1. Получить рекомбинантные плазмиды, кодирующие последовательности полноразмерных белков, и создать штаммы-продуценты на основе Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых продуктов.
2. Разработать методику выделения, очистки и концентрирования рекомбинантных белков бактерий на полисахаридном носителе.
3. Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков in vitro. 4. Изучить иммуногенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков на полисахаридном носителе у вакцинированных мышей.
5. Оценить протективные свойства полученных препаратов в моделях экспериментального заболевания при разных способах заражения.
6. Исследовать эффективность рекомбинантных антигенов в тестировании исследуемого инфицирования на основе индукции интерферона гамма. Научная новизна
На сегодняшний день широко используются рекомбинантные антигены: цитомегаловируса, вируса гепатита С, ВИЧ, Сифилис Пример получения рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для иммуноферментной диагностики сифилиса: • культивирование бледной спирохеты Treponema pallidum на кроликах; • получение природного антигена Treponema pallidum для ИФА; • литературно-теоретический анализ с целью выбора наиболее антигеннозначимых белков, видоспецифичных для Treponema pallidum; • выделение ДНК Treponema pallidum; • получение методом ПЦР генов рекомбинантных белков; • определение структуры генов; • клонирование генов в экспрессирующий вектор; • наработка рекомбинантных белков в E.coli и их выделение; • изучение возможности использования рекомбинантных белков в качестве антигена в ИФА; • получение экспериментальных партий тест-систем; • исследование сывороток больных сифилисом с помощью опытных партий тест-систем. • анализ результатов использования отдельных рекомбинантных белков и их комбинации при выявлении антител при различных стадиях инфекции. | |||||||
| 55 | Опишите перспективы применения иммуносупрессоров в транспланталогии | ||||||
Иммуносупрессивная терапия – терапия с целью подавления нежелательных иммунных реакций организма, применяется для лечения аутоиммунных болезней. При трансплантации органов иммуносупрессивная терапия необходима для предотвращения отторжения трансплантированного органа. После аллогенной трансплантации костного мозга эта терапия нужна также для профилактики и лечения острой и/или хронической реакции «трансплантат против хозяина», которая вызвана иммунной атакой донорских лимфоцитов на организм больного.
Иммуносупрессивным действием обладают глюкокортикоиды, цитостатики и многие другие лекарства: циклоспорин, такролимус (програф), сиролимус (рапамун), мофетил микофенолят (селлсепт) и т.д. Сравнительно недавно началось также применение моноклональных антител, которые позволяют избирательно воздействовать на определенные клетки иммунной системы.
Поскольку основное действие иммуносупрессантов направлено на Т-лимфоциты, то спектр инфекционных осложнений у больных, перенесших трансплантацию солидных органов, похож на таковой у больных с СПИД.
Например, иммуносупрессия приводит к реактивации большого числа латентных инфекций, включая ЦМВ, вирус ветряной оспы/опоясывающего лишая, вирус простого герпеса, вирус Эпштайн-Барр и полиомавируса человека; в случае первичной инфекции одним из этих вирусов, вплоть до угрозы жизни и потери трансплантата.
Иммуносупрессивная терапия должна сочетаться с мерами по снижению риска инфекций.
Стоит отметить, что сама успешная аллотрансплантация органов и тканей, резкое снижение процента отторжения трансплантатов и длительная выживаемость больных с трансплантатами стали возможными только после открытия и внедрения в широкую практику трансплантологии циклоспорина А.
Следующим этапом развития теории и практики иммуносупрессивной терапии в трансплантологии стало внедрение протоколов комбинированной — трёх- или четырёхкомпонентной иммуносупрессии при пересадке органов. Стандартная трёхкомпонентная иммуносупрессия на сегодняшний день состоит из комбинации циклоспорина А, глюкокортикоида и цитостатика (метотрексата или азатиоприна, или микофенолат мофетила). У больных с высоким риском отторжения трансплантата (высокая степень негомологичности трансплантата, предшествующие неудачные трансплантации и др.) обычно применяют четырёхкомпонентную иммуносупрессию, включающую также анти-лимфоцитарный или анти-тимоцитарный глобулин. Больным, не переносящим один или более компонентов стандартной схемы иммуносупрессии или подверженным высокому риску инфекционных осложнений либо злокачественных опухолей, назначают двухкомпонентную иммуносупрессию или, реже, монотерапию.
Новый прорыв в трансплантологии связан с появлением нового цитостатика флударабина фосфата (Флудары), обладающего сильной селективной цитостатической активностью в отношении лимфоцитов, и c разработкой метода кратковременной (несколько суток) высокодозной пульс-терапии глюкокортикоидами с использованием метилпреднизолона в дозах, в 100 раз превышающих физиологические. Сочетанное применение флударабина фосфата и сверхвысоких доз метилпреднизолона позволило в считанные дни и даже часы купировать остро возникающие на фоне стандартной иммуносупрессивной терапии реакции отторжения трансплантатов, что было очень трудным делом до появления Флудары и высокодозных глюкокортикоидов.
| 56 | Обоснуйте перспективы применения иммуносупрессоров при лечении аутоиммунных заболеваний |
Класс иммуносупрессивных препаратов неоднороден и содержит препараты с различными механизмами действия и различным профилем побочных эффектов. Различается и профиль иммуносупрессивного эффекта: некоторые препараты более или менее равномерно подавляют все виды иммунитета, другие имеют особую избирательность по отношению к трансплантационному иммунитету и аутоиммунитету, при сравнительно меньшем влиянии на антибактериальный, противовирусный и противоопухолевый иммунитет. Примерами таких, относительно селективных, иммуносупрессоров являются тимодепрессин, циклоспорин А и такролимус. Различаются иммуносупрессивные препараты и по преимущественному влиянию на клеточный, либо гуморальный иммунитет.
Лечение при аутоиммунных заболеваниях
Иммуносупрессоры: азатиоприн, преднизолон, тимодепрессин, циклофосфамид, циклоспорин. Биологически активные агенты (считается наиболее перспективным): блокаторы ФНО-α (инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт), блокаторы CD40-рецепторов: ритуксимаб (мабтера), блокаторы дифференцировки T-лимфоцитов (галофугинон). Иммуномодуляторы: альфетин, кордицепс.
Тимодепрессин — синтетический пептид, состоящий из D-аминокислот (глутаминовой кислоты и триптофана), соединенных γ-пептидной связью. Обладает иммунодепрессивным действием, ингибирует реакции гуморального и клеточного иммунитета. Обратимо снижает общее количество лимфоцитов в периферической крови, вызывает пропорциональное снижение уровня как хелперов, так и супрессоров. Подавляет колониеобразование и вступление стволовых клеток-предшественников кроветворения в S-фазу. Препарат угнетает спонтанную выработку фактора некроза опухолей α (ФНО-α), усиливает выработку ИЛ-7, не влияет на выработку ИЛ-1. Применяется для коррекции аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз, ревматоидный артрит, атопический дерматит, миастения, системная склеродермия и т. п.
| 57 | Обоснуйте перспективы применения иммуносупрессоров при лечении онкологических заболеваний |
Цитостатические препараты — группа противоопухолевых препаратов, которые нарушают процессы роста, развития и механизмы деления всех клеток организма, включая злокачественные, тем самым инициируя апоптоз. При этом поражаются преимущественно клетки, обладающие высоким митотическим индексом, либо клетки, биохимические процессы которых подвергаются дестабилизации цитостатиком в наибольшей степени. Среди цитостатических препаратов наиболее известны Доксорубицин, Фторурацил, Гидроксимочевина, Циклофосфан.
Способность цитостатиков подавлять синтез нуклеиновых кислот и белка обусловила первоначальное применение этих препаратов в онкологии. Однако по мере накопления клинического опыта стало ясно, что они подавляют также активность иммунной системы. Этот, как правило, нежелательный в онкологии эффект был впоследствии детально изучен и затем стал с успехом использоваться при лечении заболеваний, в патогенезе которых важную роль играют аутоиммунные механизмы. В результате цитостатики, а позже и циклоспорин стали существенной частью терапии многих аутоиммунных заболеваний.
Существующие противоопухолевые препараты не обладают достаточной избирательностью действия, и их применение может сопровождаться побочными явлениями. Они подавляют продукцию интерферона, угнетают кроветворение (приводя к лейкопении, тромбоцитопении, анемии и даже панцитопении), возможно понижение общих защитных функций организма, активация вторичной инфекции, развитие септицемии, при длительном применении они могут способствовать развитию злокачественных новообразований.
Общими противопоказаниями к применению противоопухолевых препаратов являются выраженная лейко- и тромбоцитопения, тяжелая кахексия, терминальные стадии заболевания. Вопрос об их использовании при беременности решается индивидуально. Обычно, в связи с опасностью тератогенного действия, эти препараты при беременности не назначают, как и при кормлении грудью (следует прекратить грудное вскармливание).
Разработаны лекарственные методы повышения переносимости противоопухолевых препаратов. Так, высокоэффективные противорвотные средства (блокаторы серотониновых 5-НТ3-рецепторов: ондансетрон, трописетрон, гранисетрон и др.) позволяют уменьшить тошноту и рвоту, «колониестимулирующие факторы» (филграстим, молграмостим и др.) — снизить риск развития нейтропении.
| 58 | Разработайте схему получения пектинов с помощью каллусных (клеточных) культур |
Многие исследования структуры и биосинтеза растительных полисахаридов проводятся на клеточных культурах, которые способны продуцировать полисахариды, входящие в состав клеточных стенок, в частности, пектиновые вещества: пектины и сопутствующие им нейтральные полисахариды, в основном арабиногалактаны, содержащие небольшой процент остатков D-галактуро-новой кислоты, которые придают им кислый характер.
Были разработаны методы получения каллусных культур следующих растений: смолевки обыкновенной Silene vulgaris и смолевки татарской Silene tatarica, пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare, ряски малой Lemna minor и шиповника морщинистого Rosа rugosa, – с дальнейшим выделением из них пектиновых веществ, продуцируемых данными каллусными культурами.
Для выделения пектинов из каллусной ткани использован стандартный метод последовательной экстракции растительного материала водой и 0,7%- ным водным оксалатом аммония при 68°С после предварительного гидролиза протопектина разбавленным раствором соляной кислоты (рН 4.0; 50°С). При этом найдено, что клеточные стенки каллуса смолевки обыкновенной содержат 2-12% пектинов от сухой биомассы, смолевки татарской – 3-4, пижмы обыкновенной – 5-7, ряски малой – 2-4 [1] и шиповника морщинистого – 7,4%.
Клеточные культуры представляют собой стабильную гомогенную систему, которая продуцирует в стандартных условиях пектиновые вещества с постоянной, вполне определенной структурой, что позволяет использовать их в качестве модельных соединений для изучения элементов тонкого строения, метаболизма и биосинтеза, для выяснения механизмов регуляции этих процессов для исследования взаимосвязи структуры и физиологической активности. Данные свойства клеточных культур привели к идее получения с их помощью пектиновых полисахаридов с заранее заданной структурой и свойствами.
| 59 | Разработайте процедуру получения липосомальных лекарственных препаратов |
Липосомы - микроскопические фосфолипидные везикулы, образованные одной или несколькими бислойными мембранами,- вызывают большой интерес как транспортное средство для доставки лекарственных препаратов (антибиотиков, цитостатиков, фотосенсибилизаторов), белков, пептидов, ДНК, антисмысловых олигонуклеотидов. Включенные в липосомы вещества более устойчивы, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий факторов окружающей среды.
Строительным материалом для получения лнпосом являются фосфолипиды (ФЛ) природного происхождения. В качестве источников животного происхождения используют яичный желток, мозговую ткань человека и животных, эритроциты крови животных. Из природного сырья растительного происхождения применяют соевые фосфатиды. Сходство растительных фосфолипидов с ФЛ человека обусловливает их способность, встраиваясь в биомембраны клеток и липопротеины крови, предупреждать широкий ряд возможных патологических процессом. Основным ингредиентом липосом является фосфатидилхолин с добавкой других форм фосфолипидов, в том числе отрицательно заряженных липидов, что приводит к увеличению внутреннего объема липосом и, следовательно, к увеличению объема инкапсулирования лекарственных средств.
Чтобы лекарственный препарат, вводимый внутривенно, достиг клеток-мишеней в организме, предлагаются различные способы уменьшения опсонизации: введение в состав липосомной мембраны липидов с высокой температурой фазового перехода или получение везикул с размером не более 100 нм. Но наиболее эффективным методом оказалась модификация поверхности липосом гликолипидами, например, моносиалоганглиозидами, фосфатидилинозитолом, цереброзида сульфатом и липидными производными полиэтиленгликоля (ПЭГ). Наибольшую популярность, благодаря дешевизне и простоте синтеза, получили гидрофильные полимеры ПЭГ, обладающие низкой иммуногенностью и длительным временем циркуляции в кровотоке
Одним из важнейших этапов получения лекарственных ЛС-ПР(лип.препараты) является включение активного фармацевтического ингредиента в ЛС. Сегодня известно несколько методов включения активной субстанции в ЛС: во внутренний объем наночастиц; в гидрофобную область липидного бислоя; путем адсорбции на поверхности ЛС; за счет химического связывания с компонентами бислоя. Включение вещества в ЛС может реализоваться несколькими путями: образованием липидной пленки с введением в нее липофильной лекарственной субстанции с последующей гидратацией в водной среде; гидратацией липидной пленки водой или буферным раствором, содержащим активную фармацевтическую субстанцию; методом химического градиента ионов. Одним из способов включения является использование фармацевтической субстанции, которая может взаимодействовать с компонентами мембраны ЛС с образованием комплекса.
| 60 | Объясните роль адъювантов и наноадъювантов в биотехнологическом производстве вакцин |
Появление адъювантов значительно повысило эффективность вакцинации, а также дало возможность уменьшить количество антигена в составе вакцины и число иммунизаций. К ним относятся вещества различной природы — как синтетические, так и природные, но все их объединяет способность усиливать или регулировать иммуногенность вакцинных белков и пептидов. Тем не менее, выбор адъюванта для конкретной вакцины — дело непростое, т.к. различные адъюванты стимулируют иммунный ответ по-разному. Это определяется как природой самого адъюванта, так и антигеном, входящим в состав вакцины. Следовательно, трудно предсказать, как будет стимулировать иммунитет конкретный адъювант.
В роли адъювантов могут применяться так называемые «наноэмульсии» — такие эмульсии, диаметр капель масла или воды в которых составляет 10–1000 нм (в среднем 20–600 нм). Существует два основных типа эмульсий: «масло в воде» (масляно-водные) и «вода в масле» (водно-масляные). Оба типа обладают адъювантной активностью и усиливают выработку антител на вакцинные антигены (это является важным показателем эффективности стимуляции иммунитета), но водно-масляные адъюванты более реактогенны и токсичны. По этой причине масляно-водные адъюванты широко применяются в составе лицензированных человеческих вакцин.
Примером масляно-водного адъюванта является MF59. Он представляет собой наноэмульсию сквалена в цитратном буферном растворе, стабилизированную поверхностно-активными веществами (Tween 80 и Span 85), образующую стабильные капли диаметром около 160 нм. В Европе MF59 лицензирован для применения в составе клинической противогриппозной вакцины FLUAD®, которая была введена внутримышечно десяткам миллионов людей разных возрастных категорий.
Не ясно, какой именно компонент адъюванта — сквален, Tween 80, Span 85 или цитратный буфер — является активным компонентом, отвечающим за адъювантную активность. Было показано, что все вышеуказанные эффекты MF59 — увеличение притока клеток, усиление фагоцитоза антигена и активация макрофагов в сайте инъекции, дифференцировка моноцитов в дендритные клетки, «доставка» антигена в лимфатические узлы, повышение выработки антител — проявляется только тогда, когда все компоненты входят в его состав. И все же, было продемонстрировано, что Span 85 способствует активации транскрипции генов в мышечных клетках сайта инъекции (что является еще одним принципом действия MF59). Скелетные мышцы могут участвовать в локальных иммунных реакциях и синтезировать провоспалительные цитокины, хемокины, Толл-подобные рецепторы, молекулы адгезии. А значит, именно они могут быть клетками, первично взаимодействующими с адъювантом и запускающими систему с положительной обратной связью. Скорее всего, решение обеих проблем кроется в наноструктуре MF59 и других масляных адъювантов.
