Новые методы и средства исследования

 

В XIX в. в основном изучали мертвую клетку после ее фиксации и окраски. При этом удавалось описать ряд ее органоидов и структур – митохондрии, аппарат Гольджи, клеточный центр и т. д., но более точное знание структуры и особенно функции клетки при таком методе исследования было недостижимо; кроме того, отсутствовала уверенность, что наблюдаемые на препарате картины соответствуют прижизненным.

 

Возникла необходимость, не отказываясь от этого пути исследования, совмещать его с наблюдением живой клетки. Систематическое изучение живых клеток началось только в начале XX в. благодаря открытию возможности переживания клеток в культуре вне организма.

Метод эксплантации был впервые применен американцем Р. Гаррисоном в 1907 г. На кусочках зачатка нервной системы лягушки, помещенных в каплю лимфы, он наблюдал переживание Клеток в течение некоторого времени и даже появление и рост у них нервных отростков. Метод культуры ткани был затем значительно усовершенствован в работах А. Карреля (1911–1915), М. Берроуса (1910, 1912), А.А. Максимова (1916, 1925), В. и М. Льюисов (1911 и позднее), А. Фишера (1925), А.В. Румянцева (1932) и многих других.

Широкое и полноценное использование культивируемых вне организма клеток для цитологических исследований стало возможным благодаря введению в 50‑х годах метода клеточных культур на жидких питательных средах.

 

 

Росс Гренвил Гаррисон. 1870–1959.

 

 

Клеточные культуры представляют собой популяции самостоятельных клеток, которые только вторично и далеко не всегда устанавливают между собой протоплазматические связи, однако оказывают взаимное гуморальное влияние. Клетки однослойных культур служат превосходным объектом и для проведения микроскопических исследований с использованием замедленной (цейтрафферной) микрокиносъемки. С помощью микрокиносъемки изучены движение, деление, фагоцитоз и многие другие нормальные и патологические процессы в клетках.

Наряду с применением клеточных культур в цитологии, особенно в последние годы, широко используются культуры органов, клетки которых входят в состав целых эмбриональных зачатков или фрагментов органов взрослых животных (А. Тома, 1970).

Существенное значение для развития метода прижизненного изучения клетки имело усовершенствование оптических средств исследования. К их числу относится прежде всего темнопольная микроскопия («ультрамикроскопия»), практическое применение которой стало возможно после изобретения в 1910 г. Г. Зидентопфом кардиоид‑конденсора. Важные цитологические наблюдения с использованием темнопольной методики сделал Н.М. Гайдуков (1916).

В 40‑50‑х годах широкое распространение получила фазово‑контрастная микроскопия. Ее разновидностью явилось аноптральное устройство, схему которого разработали А. Вильска (1953) и М.А. Пешков.

Прижизненному изучению клетки содействовало также развитие люминесцентной (флуоресцентной) микроскопии. В основе этого метода лежит открытие А. Келером (1904) флуоресценции объектов в темном поле при освещении их ультрафиолетовыми лучами (УФ). Широкое применение в цитологии люминесцентного микроскопа, сконструированного Келером и Зидентопфом (1908), стало возможным после того, как М. Гайтингер разработал метод окраски биологических объектов флуорохромами – веществами, обладающими способностью светиться после их УФ‑облучения. С помощью люминесцентной микроскопии получены ценные сведения о строении, обмене веществ и функционировании нормальных и патологически измененных клеток (раковых, после воздействия вирусов и т. д.).

 

 

Уоррен Льюис. 1870–1964.

 

 

Одно из наиболее важных направлений флуоресцентной микроскопии связано с применением метода флуоресцирующих антител, впервые предложенного в 1941–1942 гг. А. Кунсом и сотрудниками (1956) для выявления чужеродного антигена. Содержащиеся в сыворотке антитела связываются с флуорохромами. Меченные таким образом антитела соединяются с соответствующими антигенами и позволяют определить локализацию как бактериальных и вирусных антигенов, так и различных белков, вызывающих образование соответствующих антител. Метод флуоресцирующих антител позволил изучить локализацию и динамику накопления специфических белков, в частности ряда ферментов, появление белковых продуктов эмбриональной дифференцировки, топографию вируса и динамику его накопления в клетке, реакцию иммунокомпетентных клеток на проникновение в организм инфекции и т. д.

Основным методом изучения клетки в прижизненном состоянии стала микрургия, дающая возможность производить на клетках разнообразные операции. Разработка достаточно совершенной техники операций на клетках относится к началу XX в., когда был сконструирован микроманипулятор. Этот инструмент позволил извлекать из клетки отдельные органоиды (в частности, хромосомы), измерять электрические потенциалы с помощью микроэлектродов, вводить в клетку разнообразные вещества, бактерии, ядра и другие компоненты сходных или чужеродных клеток. Микроманипулятор был создан в самом начале XX в. одновременно С. Схоутеном (1901) в Нидерландах, М. Мак‑Клендоном и М. Барбером (1901) в США. С.С. Чахотин (1959) использовал изобретенный им микрооператор (1912) для строго локализованного воздействия на клетку пучка УФ (лучевой микроукол). С помощью локального воздействия УФ удавалось нарушить двойное лучепреломление в ахроматическом веретене (клетки подсолнечника), повредить участки митотического аппарата (в клетках тритона) и т. д. Основные работы с микроманипулятором были выполнены во втором десятилетии XX в. американским исследователем Р. Чемберсом.

 

 

Извлечение ядра из амебы с помощью микроинструмента, по П. Фонбрюну. 1951.

 

 

Наряду со значительными успехами в изучении живой клетки XX в. ознаменовался крупными достижениями и в исследовании клетки фиксированной. Первостепенную роль здесь сыграли методы цитохимии (гистохимии).

Основной задачей цитохимии является выяснение химической природы клеточных структур и продуктов жизнедеятельности клетки, а также расшифровка происходящих в ней биохимических процессов. Цитохимические методы исследования дают возможность топографически изучить локализацию ряда химических веществ и процессов. Применение всех цитохимических реакций основано на природной или искусственно создаваемой окраске изучаемых веществ. Примером цитохимических реакций первого рода является изучение пигментов в клетке, а применение реакций второго рода основано на избирательной окраске некоторых внутриклеточных веществ (например, окраска нейтрального жира Суданом) или на выпадении в результате химической реакции нерастворимого осадка какого‑либо вещества. Так, о наличии и локализации активности кислой фосфатазы судят по локализации осадка сернистого свинца в присутствии субстрата ферментативной реакции (β‑глицерофосфата).

 

 

Роберт Чемберс. 1881–1957.

 

 

Гистохимия и цитохимия берут свое начало от исследований француза Ф. Распайля, выполненных еще в 30‑х годах XIX в. Он, по‑видимому, первым использовал йодную реакцию на крахмал для его обнаружения в растительной клетке. Интенсивное развитие цитохимии началось в 30‑40‑х годах XX в., когда были предложены методы обнаружения важнейших химических компонентов клетки и опубликован ряд соответствующих руководств и статей. Основополагающее значение имели труды Л. Лизона (1936, 1953), а также работы К. Бенсли (1941), Д. Пайка (1950), Дж. Гомори (1952), Э. Пирса (1962) и многих других. Современные цитохимические методы дают возможность изучать биохимические процессы не только в неразрушенной, но иногда и в живой клетке. С помощью этих методов оказывается возможным связать изучаемый биохимический процесс с определенной клеточной структурой и прослеживать его в динамике.

 

Наряду с цитохимическими методами использовалось также дифференциальное центрифугирование, дающее возможность изолировать из клетки и разделить входящие в ее состав органоиды. Впервые дифференциальное центрифугирование было применено в 30‑х годах К. Бенсли и Н. Херром для выделения и обособленного анализа митохондрий.

Существенную роль в изучении обмена веществ клетки сыграл введенный в 1940 г. шведским ученым Т. Касперсоном метод количественного учета веществ (главным образом нуклеиновых кислот) по поглощению в изучаемом объекте УФ‑лучей определенной длины волны. Этот точный метод дает возможность получить сведения о количестве и распределении нуклеиновых компонентов клетки и некоторых других звеньев ее метаболизма.

При изучении динамики обмена веществ клетки большое распространение получило использование радиоактивных изотопов и радиоавтографии (Г. Хевеши, 1950; Дж. Бойд, 1957). Оно основано на том, что радиоактивные изотопы (Н³, С¹⁴, S³⁶, N¹⁵), подведенные к клеткам в процессе метаболизма, включаются в состав некоторых важных химических компонентов (ДНК, РНК и белков). Если покрыть гистологический срез или пластинку, на которой растет однослойная клеточная культура, жидкой фотоэмульсией, то вещества, излучающие главным образом частицы, вызовут восстановление бромистого серебра. По выявившимся зернам металлического серебра можно получить представление о локализации и количестве изучаемого вещества (Л.Н. Жинкин, 1959). Оказалось, что использование радиоактивных изотопов дает возможность изучить динамику синтеза ДНК (М. Говард, С. Пелк, 1951). Особенно большое значение для цитологии радиоавтография приобрела после того, как в 1959 г. Г. Квастлером и Ф. Шерманом был разработан метод радиоавтографии с использованием предшественника ДНК – Н³‑тимидина.

Наконец, очень важным методическим приемом, коренным образом изменившим направление цитологии, явилась электронная микроскопия. Проектирование и создание электронного микроскопа относятся к 30‑м годам и связано с именами преимущественно немецких физиков (Ф. Вольф, М. Кнолль, Э. Руска, Э. Брюхе, Г. Иохансон). Этот метод в сочетании с использованием ультратонких срезов позволяет изучить ультрамикроскопическую структуру всех основных органоидов (современные электронные микроскопы обладают разрешающей способностью в несколько микронов). Применение электронного микроскопа привело к перестройке классических представлений не только о строении клетки, но и о ходе многих процессов ее жизнедеятельности.

Наибольшие результаты дает сочетание высокой техники электронномикроскопического исследования с комбинированным применением радио‑ автографических и цитохимических методов. Используя связывание тяжелых металлов (свинца, кадмия) определенными компонентами клетки, можно выяснить ультрамикроскопическую локализацию ферментативной активности (сукцинатдегидрогеназной, фосфатазной и т. д.) Точно так же, определив на ультратонких срезах место локализации металлического серебра после предварительного введения радиоизотопов, можно получить данные об участках метаболической активности клетки.

В настоящее время в области ультраструктуры клетки после работ А. Клода (1940), Г. Палада (1952, 1953), Ф. Шёстранда (1956), К. Портера (1961) и других достаточно отчетливо выяснены как общая схема строения клетки, так и организация ее отдельных структурных элементов.

Сравнительно недавно были обнаружены, описаны и идентифицированы эндоплазматическая сеть, мембранная система, лизосомы, фагосомы, микротельца, микротрубочки и другие структуры. Ядро, ядрышко, митохондрии, комплекс Гольджи, клеточный центр, плазматическая и ядерная оболочки, известные ранее, описаны при помощи новых методических приемов во всех ультраструктурных деталях. С помощью электронной микроскопии удалось выяснить морфологический субстрат основных процессов, происходящих в клетке, – пассивного и активного проникновения в нее различных веществ, слияния и рекомбинации мембран, выделения секретов, фагоцитоза и пиноцитоза, движения и сократимости, проведения нервных импульсов (см. главу 11).

Таким образом, развитие техники цитологических исследований и введение некоторых принципиально новых методических приемов одновременно послужило предпосылкой развития цитологии и предопределило формирование основных направлений, по которым пошло ее дальнейшее развитие.

 

 

Физико‑химическое изучение клетки.

 

Одним из основных направлений цитологии в первой трети XX в. было изучение физико‑химических свойств клетки. Значительные успехи были достигнуты в исследовании физических свойств и коллоидного состояния протоплазмы. Были получены исчерпывающие данные о ее основных физических свойствах – вязкости, эластичности, электрическом заряде, поверхностном натяжении, концентрации водородных ионов, проницаемости, чувствительности к различным (в частности, лучевым) воздействиям и т. д. Работы Р. Чемберса, Т. Петерфи, Ж. Лёба, В. Зейфрица, Ф. Вебера и многих других заложили основы этой области цитологии. Результаты исследований получили отражение в крупных сводках и руководствах. Таковы: «Физическая химия клетки и тканей» (1911) Р. Гёбера, «Коллоидная химия протоплазмы» (1929) Л. Гейлбруна, «Проблема проницаемости» (1929) Е. Гельхорна, «Протоплазма» (1936) В. Зейфрица и многие другие.

Физико‑химическое изучение клетки получило широкое развитие в 20‑х годах и в Советском Союзе. Центром исследований в этой области стал московский Институт экспериментальной биологии, руководимый Н.К. Кольцовым. Именно здесь были выполнены важные работы самого Н.К. Кольцова, С.Н. Скадовского, Г.В. Эпштейна. В итоге было детально изучено влияние на клетку водородных ионов, заложено представление о физико‑химических основах раздражимости пигментных, мускульных и железистых клеток. Особенно много внимания Кольцов уделил физико‑химическому анализу формы клеток. Именно под этим углом зрения выполнены его классические исследования строения спермиев десятиногих раков, сократительного стебелька сувойки и др. Основной задачей Кольцов ставил изучение структур и элементарных процессов, обеспечивающих всю сложность жизни клетки. Книга Кольцова «Организация клетки» (1936), обобщившая результаты его 30‑летней работы и отразившая его теоретические представления, внесла существенный вклад в цитологию. Основным выводом из исследований Кольцова и его школы явилось представление о твердом скелете, который в той или иной форме присутствует в любой клетке и определяет ее организацию.

Физико‑химическое изучение клетки велось также в Институте биохимии им. А.Н. Баха (Д.Л. Рубинштейн, В.А. Дорфман и др.). Выполненные здесь исследования касались вопросов проницаемости клетки, электрометрии (в первую очередь изучения клеточных потенциалов), а также ее диэлектрических свойств.

Для выяснения физико‑химических свойств клетки много сделал в Московском университете А.В. Румянцев, который справедливо может считаться одним из основателей московской цитологической школы. Работы Румянцева, начало которых относится к первой половине 20‑х годов, посвящены изучению строения и свойств живой клетки при воздействии разнообразных химических и физических факторов. Они содержали значительную долю здорового скептицизма по отношению к результатам, полученным на фиксированных и окрашенных препаратах. И действительно, некоторые классические клеточные структуры оказались всего лишь артефактами. Так, уже в первой большой цитологической работе (1925), посвященной изучению протоплазмы корненожек, Румянцев выяснил природу так называемых хромидий – цитоплазматических образований, окрашивающихся подобно хроматину, которые одно время считались важными органоидами клетки. Румянцев показал, что речь идет об остатках разрушенных митохондрий и аппарата Гольджи, вряд ли имеющих какое‑либо физиологическое значение.

 

На клетках культуры ткани были исследованы аппарат Гольджи, митохондрии, структуры ядра, строение цитоплазмы в норме и при воздействии разнообразных физических и химических факторов – изменении реакции среды, воздействии некоторых ионов и солей. Несмотря на кажущуюся пестроту вопросов, эти исследования имели свою внутреннюю логику – изучалась протоплазма как субстрат жизненных явлений, выявлялись пределы ее реактивности, устанавливались причины ошибок, основанных на некритическом отношении к результатам изучения статических картин.

Некоторые исследователи уже в первые десятилетия XX в. пытались связать данные о физико‑химических свойствах клетки с ее функциями. Новое физиологическое направление в цитологии особенно отчетливо выявилось в работах Д.Н. Насонова. В начале 20‑х годов он приступил к изучению одного из труднейших для истолкования органоидов клетки – аппарата Гольджи. Открытая в конце XIX в., эта структура привлекала к себе пристальное внимание исследователей, однако вопрос о реальном существовании и особенно функциональном значении аппарата Гольджи долгое время оставался открытым. В результате исследования, проведенного на различных железах амфибий, Насонов (1923, 1963) пришел к заключению, что аппарат Гольджи является основным органоидом внутриклеточной секреции. В своих исследованиях он использовал экспериментальный подход – животным вводился пилокарпин, стимулирующий клеточную секрецию, что приводило к освобождению клетки от секрета и позволяло исследовать роль аппарата Гольджи в возникновении процесса секреции.

Почти одновременно с изучением аппарата Гольджи‑Насоновым американский исследователь Р. Боуэн (1924, 1925) выполнил серию работ, посвященных сперматогенезу у насекомых и секреторному процессу в железах моллюсков, амфибий, птиц и млекопитающих. Он получил результаты, полностью совпавшие с выводами Насонова: аппарат Гольджи продуцирует клеточный секрет. Одновременно Боуэн показал существование различий в структуре этого органоида у беспозвоночных и позвоночных и высказал предположение, что такие различия связаны с особенностями секреции этих групп.

В одной из работ Насонова (1926) было исследовано накопление кислого витального красителя (трипанового синего) в клетках печени и почек различных позвоночных. При этом было показано, что краситель концентрируется в области аппарата Гольджи, не вызывая каких‑либо его морфологических изменений. Полученные результаты дали автору основание считать, что деятельность аппарата Гольджи сводится к избирательной концентрации находящихся в клетке веществ, независимо от того, образуются ли они на месте или поступают в клетку извне. Эти представления Насонова о функции аппарата Гольджи в основном сохраняют свое значение и в настоящее время.

Большое число исследований первой трети XX в. было посвящено витальному окрашиванию. Биологическое значение этого метода заключается в том, что он дает возможность прижизненно изучить закономерности поступления, накопления и выделения входящих в клетку веществ. Иными словами, он позволяет создать модель процессов обмена веществ. Витальное окрашивание (его феноменология и механизм) детально описаны в работах Г. Эванса и В. Шулемана (1915) и В. Меллендорфа (1920). Большую роль в развитии этого направления исследований сыграли работы Н.Г. Хлопина (1927), выдвинувшего представление о криномах – структурах, предсуществующих в клетке или возникающих заново, которые связывают попадающие в клетку вещества, в частности красители. В дальнейшем ряд важных исследований по изучению реакции клетки на введение анилиновых красителей был выполнен Б.В. Кедровским (1936), разработавшим представление о роли гранул как сегрегационного аппарата клетки. С развитием электронно‑микроскопических исследований выяснилось, что гранулярный аппарат клетки тесно связан с ультрамикроскопическими структурами – лизосомами, которым в настоящее время отводится важная роль в физиологии нормальной и патологически измененной клетки.

 

 

Дмитрий Николаевич Насонов. 1895–1957.

 

 

Значение витальной окраски для характеристики физиологического состояния клетки особенно четко показано в работах Д.Н. Насонова и В.Я. Александрова, сформулировавших теорию паранекроза (1940). Она основывалась на следующих наблюдениях: в норме основные красители откладываются в виде гранул в цитоплазме, ядро остается неокрашенным и интенсивность гранулообразования сравнительно невелика. При умеренном раздражении, связанном с уменьшением дисперсности белков цитоплазмы и с повышением ее сорбционных свойств, количество и размеры гранул возрастают. Значительное повреждение клетки сопровождается потерей способности к гранулообразованию, появлением диффузной окраски цитоплазмы и прокрашиванием структур ядра. Эти изменения, наблюдаемые при разнообразных внешних воздействиях, являются монотонным ответом на них любой клетки и соответствуют ее своеобразному некробиотическому состоянию, которое было названо авторами паранекрозом. Ранние стадии этого состояния обратимы. В гибнущей клетке вследствие денатурации белков диффузная окраска цитоплазмы и ядра сохраняется.

Авторы рассматривают образование гранул (или оседание красителя на предсуществующих структурах) как проявление действия защитного механизма, с помощью которого из основной цитоплазмы удаляются посторонние или вредные вещества. В случаях, когда клетка повреждена, этот защитный механизм нарушается и гранулярная окраска становится уже невозможной. Таким образом, гранулообразование может служить одним из достаточно тонких индикаторов физиологического состояния клетки не только при естественных колебаниях ее жизнедеятельности, но и в тех случаях, когда на клетку действуют извне разнообразные (в том числе повреждающие) факторы.

Теория паранекроза дает возможность объяснить однообразие ответа клетки на разнообразные внешние воздействия. Она послужила основой при изучении другого, очень важного раздела физиологии клетки – проблемы проницаемости.