При подозрении в заболевании рыб грибковыми болезнями проводят микологические исследования.
Обычно при микозах рыб нет необходимости проводить полный комплекс микробиологических исследований, но иногда приходится определять видовую принадлежность грибов с последующим изучением их свойств. Для этого грибы выращивают на специальных средах.
При исследовании на бранхиомикоз микроскопируют не-кротизированные, подвергшиеся гнилостному разложению участки жабр больных рыб. Лепестки жабр помещают на предметное стекло в несколько капель воды, раздавливают вторым предметным стеклом и просматривают при малом увеличении. В поле зрения микроскопа хорошо видны гифы гриба и споры.
При гистологическом исследовании жабр на срезах в капиллярах и респираторных складках видны гифы гриба и споры, которые окрашиваются гематоксилином в темно-лиловый цвет, а эозином — в красный.
Для выращивания возбудителя бранхиомикоза на питательных средах берут патологический материал только от тру-
|
|
209
пов рыб, жабры которых подверглись разложению, потому что из свежей жаберной ткани живых рыб выделить гриб практически невозможно. Отобранный материал соответствующим образом подготавливают и высевают на агар Сабуро, Чапека, МПБ или кровяной бульон и выращивают при температуре 20—22 °С.
При микроскопии культуры гриба хорошо видно несепти-рованный мицелий, состоящий из сильно разветвленных гиф шириной 8—30 мкм. Внутри гиф просматриваются споры диаметром 5—9 мкм.
Для обнаружения сапролегниевых грибов исследуют под микроскопом соскобы с кожи, жабр, носовых ходов, а также икру. При этом хорошо просматриваются гифы гриба и зооспоры.
Сапролегниевые грибы выращивают в пробирках, содержащих стерильные семена конопли или льна в дистиллированной воде. Через 2—3 дня на семенах появляется веткоподоб-ный рост гриба. Полученную культуру промывают стерильной дистиллированной водой для того, чтобы избавиться от бактерий, и опять высевают на семена. Так повторяют несколько раз. Затем берут один гиф гриба и высевают на агар Чапека, Сабуро, МПА.
Гриб хорошо растет на кусочках вареной бараньей печени в стерильной воде. Выращивают в термостате при температуре 20—22 °С. Через 2—3 дня появляется характерный рост чистой культуры гриба в виде больших пушистых белоснежных колоний, состоящих из свободных, толстых несептироваппых гиф.
Ихтиоспоридиевы грибы культивируют на мясо-пептонном агаре с 1 % сыворотки крови крупного рогатого скота.
Биологическая проба
Биологическую пробу проводят при необходимости установить заразность патологического материала или вирулентность выделенных чистых культур вирусов, бактерий, грибов.
|
|
Кроме того, биопробу ставят при решении вопроса о снятии карантина и ограничений с хозяйства при многих инфекционных заболеваниях.
Для биопробы берут клинически здоровую, упитанную рыбу из благополучных водоемов, восприимчивую к предполагаемому заболеванию.
Биопробу можно ставить в аквариумах, садках, чанах, а также в карантинных или изолированных прудах. В любом случае необходимо поддерживать оптимальный гидрохимический ре-
210
жим и кормление, характерные для вида и возраста рыб, взятых в опыт.
При постановке биопробы используют чистые культуры вирусов, бактерий, грибов, а также суспензии и взвеси, приготовленные из свежего патологического материала.
Заражают рыб патологическим материалом так. В стерильную ступку отбирают кусочки печени, почек, селезенки, мозга, жидкость брюшной полости и др., добавляют туда стерильное стекло или песок и тщательно растирают. Полученную суспензию разбавляют стерильным физиологическим раствором (1: 10) и фильтруют через стерильную марлю, после чего используют для заражения подопытных рыб. Суспензию вводят в брюшную полость в области брюшного плавника в дозе 0,2—0,3 мл рыбам массой 20—30 г или втирают в скарифицированную поверхность кожи в области спинного плавника. Воспроизведение болезни при введении рыбам изучаемого материала указывает на его заразность.
Для подтверждения вирусной этиологии болезни обычно используют зараженные вирусным агентом однослойные клеточные культуры.
Вируссодержащий культурный материал вводят в брюшную полость карпам массой 20—30 г в дозе 0,2—0,3 мл, а форели массой 10 г — 0,1 мл. Иногда заражение проводят контактным способом при совместном содержании здоровых и больных рыб.
При заражении рыб бактериями используют одно-, двухсуточные культуры, разведенные стерильным физиологическим раствором до концентрации 1 млн. микробных тел в 1 мл. Материал вводят в брюшную полость карпам массой 20— 30 г в дозе 0,1 мл, 30—50 г— 0,2 мл и массой 60—100 г — 0,3 мл.
При диагностике микозов для постановки биопробы используют нативный материал, содержащий возбудителя на всех стадиях развития, или же применяют чистые культуры патогенных грибов, выращенные на специальных питательных средах.
Для определения токсичности водной среды (без дифференциации ядов) проводят биологическую пробу непосредственно в водоемах, где наблюдается гибель рыб, или в аквариумах, наполненных водой из обследуемого источника. В опыт берут наиболее чувствительных к токсическим веществам рыб (окунь, ерш, форель, щука, гуппи), а также водных беспозвоночных (дафний, личинок хирономид и др.). Биологическая проба при этом позволяет очень быстро определить токсичность воды и наметить пути дальнейших диагностических и химико-аналитических исследований.
211
В каждой серии опытов при исследовании одного материала используют для заражения не менее 10 рыб, такое же количество берут и на контроль. Чтобы исключить случайные результаты биопробы, опыт и контроль повторяют дважды.
Результаты биологической пробы определяют по характеру клинических признаков болезни, патологоанатомическим изменениям, смертности подопытных рыб при полном сохранении контрольных и выделению исходного возбудителя от заболевших или погибших рыб.
Биологическая проба считается положительной, если у 50 % и больше подопытных рыб ярко проявляются клинические и патологоанатомические признаки болезни, с последующей гибелью больных рыб при полном сохранении их в контроле. Сроки появления клинических признаков и гибель рыб для каждой болезни различны. Они зависят от инкубационного периода болезни, для выявления которой поставлена биопроба, температуры воды, состояния подопытной рыбы. При острых инфекциях симптомов болезни может и не быть, так как гибель рыб наступает до их развития. При отсутствии признаков болезни у подопытных рыб за ними наблюдают в течение 3 недель, после чего результат биопробы считается отрицательным.
|
|
По окончании опытов рыбу утилизируют, а емкости, в которых она содержалась, дезинфицируют 10 %-ным раствором хлорной извести.