Метод прямого подсчета по Виноградскому

Исходное разведение почвы готовят так же, как и при использовании первого метода определения общего количества микроорганизмов. Для дальнейшей работы берут стерильной пипеткой суспензию из разведения 1:100 и наносят 0,01 мл   на обезжиренное предметное стекло на площади в 4 см. Чтобы правильно распределить каплю по стеклу, под него подкладывают квадратик бумаги размером 2х2 см. Препарат высушивают, фиксируют на пламени горелки, окрашивают по Граму и микроскопируют, используя иммерсионный объектив. При просмотре препарата подсчитывают количество бактерий, находящихся в 100 полях зрения микроскопа или 100 квадратиков окулярной сетки. Вычисляют среднее количество бактерий в одном поле зрения и затем определяют содержание микроорганизмов в 1 г почвы. Пример. Квадратик сетки имеет площадь 0,004 мм (край сетки = 0,02 мм), значит на 1 см он будет повторяться 25000 раз, а на всей площади препарата 100000 раз. В препарате было обнаружено, в среднем, 2 бактерии в одном квадратике. Тогда на препарате площадью 4 квадратных сантиметра будет 200000 бактерий (2х 100000).     

Определение общего количества бактерий группы кишечной палочки - БГКП

Метод мембранных фильтров

Этот метод применяют для определения БГКП. Почвенную суспензию, приготовленную так же, как в предыдущем  исследовании, (см. определение общего количества микроорганизмов  в почве),  разводят от 1:10 до 1:1000  при исследовании чистых почв и от 1:1000 до 1:1000000 – при изучении загрязненных почв. Затем 5 или 10 мл полученных разведений фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм в аппарате Зейтца. Фильтры помещают на среду  Эндо, в состав которой входят мясопептонный агар, лактоза и индикатор и инкубируют в термостате при температуре 37º С в течение 24 ч. При наличии бактерий группы кишечной палочки на фильтрах появляется рост колоний темно-красного цвета с металлическим блеском. Из колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму, и микроскопируют. БГКП имеют палочковидную форму и при окраске приобретают красный цвет (т.е. являются грамотрицательными). Затем с культурой грамотрицательных лактозоположительных бактерий ставят оксидазный тест, который позволяет дифференцировать представителей семейства Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae. Для определения оксидазной активности часть исследуемой колонии переносят стерильной петлей на фильтровальную бумагу, пропитанную диметил -n-фенилендиамином и a-нафтолом. У микроорганизмов, продуцирующих оксидазу, цвет колонии  становится сине-фиолетовым.   Бактерии группы кишечной палочки являются оксидазоотрицательными и не изменяют своего цвета. Дополнительно проверяют способность исследуемой культуры ферментировать глюкозу и разлагать белки. Колонии, выросшие на фильтрах на среде Эндо, учитывают как БГКП, если они образованы грамотрицательными, оксидазонегативными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не разлагающими белки.

Для определения общего количества БГКП в исследуемой почве, подсчитывают количество колоний, выросших на  фильтре, через который был пропущен определенный объем разведения почвенной болтушки.  Затем вычисляют, сколько бактерий группы кишечной палочки содержится в одном миллилитре этого разведения. Общее количество БГКП   подсчитывают, умножая показатель содержания этих микроорганизмов в 1 мл на соответствующее разведение. Пример: Было профильтровано 10 мл из разведения 1:10000. На фильтре выросло 20 колоний. Составляем пропорцию: В 10 мл -20 бактерий, а в одном –х. Получаем результат: Х= (20 × 1): 10 = 5 бактерий. Поскольку проба для фильтрования была отобрана из разведения 1:10000, умножаем 5 на 10000. Окончательный итог – в 1 г. почвы содержатся 50000 БГКП.