2020-05-12
362
КОНЦЕНТРАЦИЯ ЯДА
Исход опытов по испытанию токсичности того или иного вещества для рыб определяется двумя важнейшими переменными: концентрацией яда и временем его действия на организм. Концентрация токсиканта при: постоянном времени действия на организм играет решающую роль в определении выраженности и исхода токсического процесса, а стало быть, и в оценке самого факта вредности исследуемого соединения для рыб.
Вопрос о концентрациях химического вещества, при которых оно становится токсичным или летальным, был и остается одним из самых трудных и противоречивых. Об этом свидетельствует огромный диапазон концентраций, указываемых различнымд авторами, в качестве токсических или летальных буквально по каждому классу изученных химических соединений, будь то соли тяжелых металлов, щелочи, кислоты, пестициды или другие яды органического ряда. В качестве примера сошлемся на литературные данные, характеризующие токсичность фенола для рыб. По данным одних авторов, повреждающие или летальные концентрации фенола изменяются от менее чем 1 до 5 мг/л [441, 797, 798,.. 542, 490, 809], по данным других [599, 76, 310, 261, 537, 540], порог токсичности или летального действия: фенола для различных видов рыб лежит в пределах. 10—20 мг/л. В то же время, по мнению ряда исследователей [809, 714, 310, 769, 537, 40], в этих же пределах: лежит область относительно безвредных концентраций яда (0,1-18 мг/л).
|
|
|
Таким образом, токсические и летальные концентрации фенола, полученные авторами в различных методических условиях, различаются подчас в 10-20 раз!
Аналогичная картина вырисовывается при анализе литературных данных, характеризующих минимальные летальные или токсические концентрации других химических веществ с той лишь разницей, что нередко расхождения между данными различных авторов еще более внушительны. Так, концентрация цианидов 10 мг/л, приведенная А. Кейсом [637] в качестве «возможно токсичной для рыб», примерно в 100 раз превышает концентрации, вызывающие летальное отравление многих видов рыб. Чрезвычайная противоречивость в рекомендациях отдельных авторов относительно минимальных летальных концентраций различных компонентов промышленных сточных вод для рыб в значительной мере объясняется отсутствием единых критериев оценки токсичности испытуемых веществ, недостаточным вниманием к количественной характеристике реакций рыб па ядовитые вещества. Между тем вопросы количественной оценки токсичности химических веществ привлекают все большее внимание специалистов в связи с необходимостью эффективного разрешения основной задачи токсикологии — установления ПДК вредных веществ во внешней среде. Аналогичная задача — определение и обоснование ПДК различных ядовитых компонентов сточных вод — стоит и перед ихтиотоксикологией.
|
|
|
В связи с единством основных задач, стоящих перед общей токсикологией и ихтиотоксикологией, их методологическим родством мы считаем необходимым в конспективной форме изложить основные идеи, принципы и методы количественной оценки токсического эффекта, используемые в общей токсикологии.
Известно, что реакции животного на токсическое раздражение возникают при определенной концентрации или дозе токсического агента, а интенсивность их нарастает параллельно увеличению концентрации токсиканта. Иными словами, реакции организма, обусловленные воздействием токсических агентов, носят градированный характер, что позволяет весьма полно характеризовать токсикодинамику испытуемого вещества, но чрезвычайно затрудняет количественную оценку его токсической активности. Для преодоления этого препятствия было предложено использовать не всю гамму возникающих в организме сдвигов, а лишь конечный эффект, т. е. гибель или выживание животного. Такой способ оценки токсического эффекта в альтернативной форме по принципу «все или ничего» (квантовые реакции) получил в настоящее время широкое распространение и позволил наиболее точно на основе математических методов проводить количественную оценку токсических свойств изучаемого соединения и сопоставлять получаемые результаты.
Исходя из этого, в настоящее время принято различать летальные дозы и концентрации (соответственно DL и CL) и токсические дозы и концентрации, т. е. не вызывающие летального исхода, но оказывающие вполне определенный эффект (DE и СЕ — эффективные). Чаще для характеристики токсичности испытуемого вещества исследователи стремятся располагать данными о всей амплитуде токсических и летальных концентраций, начиная от максимально переносимых CL0 (концентрация максимально переносимая) и минимальной летальной CLM (концентрация летально-минимальная) до CL100 (концентрация летальная для 100% испытуемых животных).
Летальные концентрации. В ихтиотоксикологии абсолютное большинство авторов, характеризуя степень токсичности того или иного вещества, обычно используют в качестве критерия CL100, т. е. наименьшую концентрацию, вызывающую гибель всех взятых в опыт рыб. Однако из работ Ш. Д. Мошковского [241], Н. С. Правдина [289] и некоторых других известно, что критерий CL100, как и DL100, несет ограниченную информацию о степени токсичности того или иного яда и в значительной мере определяется количеством использованных в опыте животных. Если обозначить вероятность гибели каждой рыбы, подвергшейся воздействию яда данной концентрации, через Р, то вероятность гибели всех рыб п в растворе яда этой концентрации будет равна Рп. В то же время вероятность того, что какая-то одна (или несколько) из взятых в опыт рыб выживает, окажется равной 1- Рп. Величина 1- Рп с повышением количества рыб п возрастает и (1-Рn)→1. Следовательно, чем больше по объему испытуемая группа рыб, тем больше вероятность, что какая-то рыба при данной концентрации выживет, а стало быть, CL]00 с возрастанием количества используемых в опыте рыб будет увеличиваться. Вполне понятно, что все сказанное относится и к CL0, только в этом случае с увеличением количества подопытных рыб п будет уменьшаться минимальная летальная концентрация. Если учесть к тому же, что в большинстве ихтиотоксикологических экспериментов количество подопытных рыб бывает весьма ограничено, а нередко и совсем не указывается, то станет понятной неопределенность и малая ценность приводимых данных.
Более важным показателем зоны летальных концентраций исследуемого вещества является CL50 (средняя летальная концентрация, вызывающая гибель 50% животных). В ихтиотоксикологии этот критерий был впервые введен П. Дудоровым [532], предложившим биологический метод оценки токсичности веществ, основывающийся на определении среднего предела устойчивости (TL M — толерантный лимит). Он представляет собой концентрацию яда, которая убивает 50% испытуемых рыб за 24, 48 и 96 ч в экспериментальных условиях. В настоящее время в США этот метод оценки токсичности вещества принят большинством исследователей.
|
|
|
Имеется несколько хорошо разработанных методов расчета и определения CL50. Среди методов математического расчета CL 50 наибольшее распространение получили два: метод Кербера [635] и метод Першина [269]. Первый из них предполагает одинаковое количество подопытных животных (не меньше 6) на каждую из 4-5 испытуемых концентраций в диапазоне от CL0 до CL 100 (желательны одинаковые интервалы между концентрациями):
где М — число погибших животных от исчисляемой концентрации; H — число погибших животных от предыдущих концентраций; а — исчисляемая концентрация; b — предыдущая концентрация.
По методу Першина расчет CL50 возможен и в том случае, если интервалы между концентрациями неодинаковы и количество подопытных животных на каждую концентрацию также различно:
При расчете CL50 по методу Першина М и Н представляют собой не числа погибших животных, а проценты летальности.
Другая группа методов основана на определении CL50 по кривой летальности, или характеристической кривой, отражающей распределение индивидуальной устойчивости животных к исследуемому токсическому агенту. Большинство авторов считают при этом, что распределение частот индивидуальных эффектов в вариационном ряду приближается к нормальному распределению (кривая Гаусса-Лапласа). Характеристическая кривая строится путем нанесения доз или концентраций на оси абсцисс, а процента летальности (или частоты любого другого учитываемого токсического эффекта) — на оси ординат.
|
|
|
Подчас зависимость между концентрацией и эффектом (в данном случае процентом гибели животных) при графическом изображении приобретает форму симметричной S-образной кривой (рис. 6). Происхождение сигмоидной формы характеристической кривой, по мнению В. М. Карасика [108], легче всего объяснить исходя из ее родства с кривой нормального распределения, так как обе кривые отражают распределение частоты признака в изучаемой выборочной совокупности. Обычно количество высокоустойчивых и малоустойчивых животных незначительно и нарастает по мере приближения к моде вариационного ряда. Основываясь на этом принципе, В. М. Карасик считает, «что сигмоидная форма характеристической кривой отвечает резкому переходу от менее частых вариантов к более частым, и наоборот. Чаще, однако, сигмообразные кривые оказываются не симметричными и даже вовсе не S-образными, приближаясь по форме к показательным кривым, или приобретают очень растянутый S-образный вид». Правда, прилогарифмировании концентраций кривые становятся более симметричными, однако А. Кларк [486, 487], анализируя характер связи между концентрацией вещества и его активностью, приходит к выводу, что форма кривых при квантовых реакциях может быть различной для разных веществ. Тем не менее характеристическая кривая приобрела исключительное значение для количественной оценки токсичности испытуемого вещества.
Рис. 6. Соотношения между кривой нормального распределения (а)
и соответсвующей ей характеристической кривой (б)
Поскольку при построении характеристической кривой, получаемые эмпирические точки нередко широко разбросаны, что не позволяет провести между ними закономерную кривую, было предложено несколько статистических методов для выравнивания опытных данных. Чаще других используется метод скользящей средней, метод наименьших квадратов Боярского [25] и метод пробитов. Наиболее простым из них, но дающим удовлетворительное согласование, оказался метод скользящей средней, согласно которому ожидаемые величины летальности получают путем вычисления средней арифметической между определяемым, предыдущим и последующим наблюдаемыми значениями. При использовании этого метода можно получить плавную кривую с характерным сигмоидным изгибом. Основными недостатками метода являются значительная погрешность определения величины при малом числе опытов и необходимость соблюдения равных интервалов между концентрациями.
Метод пробитов основан на преобразовании характеристической кривой в прямую путем нанесения на ординату процентов летальности с учетом вероятности их ошибки. Получается вероятностная шкала, характерная особенность которой — сближение делений в области 50% и растянутость в районе 0 и 100%. Проценты летальности, найденные опытным путем, переводятся в пробиты по таблице Блисса [455]. Метод характеризуется относительной точностью, простотой выполнения.
Сейчас уже ни у кого не вызывает сомнений, что в качестве параметра токсичности целесообразно использовать не CL100, а СL50. Однако сама по себе эта характеристика будет неполной, если не указать стандартного отклонения (среднеквадратическая ошибка), характеризующего степень рассеяния или изменчивости CL50. Тем не менее в тех немногих работах по токсикологии рыб, в которых токсичность вещества характеризуется величиной TLM [820, 821, 463, 615], авторы, как правило, не указывают ее ошибки, что значительно снижает ценность полученных данных.
Существуют различные методы определения средней ошибки, и некоторые из них, например метод Берепса и Шлоссера [440], основываются на определении этой величины непосредственно по данным эксперимента. Однако сложность вычисления средней ошибки по этому методу привела к использованию более простых и быстрых, хотя и менее точных методов ее расчета по пробитной кривой. При этом исходят из положения, что разность между концентрациями, определяющими гибель 16 и 84% взятых в опыт животных, равна удвоенному стандартному отклонению. Если известно число животных, использованных в интервале этих концентраций, то легко установить ошибку CL50. Из многочисленных методов, основанных на этом принципе, чаще других используются два: метод Литчфильда [668] и метод Миллера и Тейнтера [713]. Согласно первому из них ошибка SCL50 рассчитывается по формуле:
где 2δ = (CL-84) — (CL-16), а N — число животных, использованных в опытах между концентрациями CL — 84и CL— 16.
Расчетная формула Миллера и Тейнтера сходна с первой:
однако в ней учитывается число животных, использованных в интервале концентраций, вызывающих гибель 6,7 и 93,3% особей. Этот метод, видимо, наиболее предпочтителен, поскольку он учитывает большее количество опытных данных.
Хотя большинство токсикологов для оценки токсичности вещества используют СЬ50, тем не менее следует иметь в виду ее существенный недостаток: CL50 базируется на определении токсичности вещества для наименее устойчивых 50% животных. В связи с этим заслуживает внимания рекомендация В. М. Карасика [109] характеризовать токсичность вещества той концентрацией, которая вызывает гибель наибольшего числа животных испытуемой группы, т. е. летальность, соответствующую моде вариационной кривой. В качестве показателя изменчивости этой концентрации, по мнению В. М. Карасика, может быть использована высота этой моды, т. е. процент гибели. Фактически в некоторых областях частной токсикологии, например при изучении фунгицидов, используют не CL50, a CL95 [609]. И хотя CL50 предпочтительнее с точки зрения ее расчета и незначительного количества используемых животных, однако CL95 больше устраивает практиков в силу большей определенности получаемых результатов. При этом CL95 существенно отличается от CL100, критическую оценку которой мы дали выше, тем, что она имеет не абсолютный, а вероятностный характер (при уровне значимости 0,95). Это делает CL95 и CL05 вполне определенными с точки зрения оценки токсичности вещества в области летальных концентраций и сопоставимости экспериментальных данных различных авторов независимо от количества использованных в опыте животных.
Зона токсического действия. Наряду с использованием летальных и пороговых концентраций, характеризующих степень токсичности вещества для животных, весьма ценным критерием токсичности является зона токсического действия, которая «...для установления предельно допустимых концентраций... дает больше, чем какой-либо отдельно взятый показатель токсичности, как, например летальная концентрация» [289]. Обычно для расчета зоны токсического действия используют три основных параметра токсичности: CL50 или CL100 и пороговые концентрации. Согласно Н. С. Правдину [289] под зоной токсического действия подразумевается диапазон концентраций от пороговых до летальных (CL100). Другие авторы используют отношение СL50 к пороговой величине. Хотя использование авторами различных показателей токсичности и создает определенные трудности в количественной оценке зоны токсичности действия, однако опыт показывает, что допустимые концентрации исследуемого вещества, вычисленные по формуле, учитывающей широту зоны токсического действия, стоят наиболее близко к экспериментальным величинам.
В литературе по ихтиотоксикологии нам не удалось обнаружить каких-либо сведений относительно зоны токсического действия того или иного компонента промышленных сточных вод. Обычно авторы, характеризуя токсичность вещества для рыб и степень устойчивости последних, используют лишь несколько концентраций и указывают одну из двух величии: CL100 или TLМ. Вследствие этого мы не имеем никакой информации относительно того, как нарастает реакция рыб с изменением концентрации яда. А это имеет чрезвычайно большое значение в практическом отношении. Для подтверждения сказанного сошлемся на результаты наших опытов [193], проведенных на 2-летней форели. Использовали следующие концентрации фенола: 5, 7, 5, 10, 12, 5, 15, 20 и 25 мг/л. Действие каждой концентрации фенола испытывалось на 12-20 экземплярах рыб в 300-литровых аквариумах. Опыты проводили при температуре воды 12-14° С, содержании кислорода 9,6-10,2 мг/л, рН 6,8-7,2.
Установлено, что внутри очень маленькой области концентраций токсичность фенола для форели резко возрастает (табл. 9). Увеличение концентрации фенола всего на 2,5 мг/л (от 5 до 7,5 мг/л) приводит к гибели 50% испытуемых рыб, а последующее увеличение ее еще на 2,5 мг/л вызывает уже 100%-ную гибель рыб и при том за весьма короткое время — 129 мин. При дальнейшем повышении концентрации фенола с 10 до 15 мг/л время гибели рыб сокращалось в 3 раза.
Таблица 9
