2020-05-11
2451
Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: а) приготовление мазка, б) высушивание, в) фиксация, г) окраска.
а) Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони. Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры наносят петлей на предметное стекло. Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал. Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым, округлой формы, размером 1,5-2смІ.
б) высушивание мазка производится на воздухе или для ускорения предметное стекло с мазком, обращённым кверху, можно подержать в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, но не вносить в огонь.
|
|
|
в) после высушивания производят фиксацию (прикрепление к стеклу) препарата. Для этого стекло с мазком, обращённым кверху, медленно проводят через пламя 3-4 раза. При этом микробы погибают, приклеиваются к стеклу и не смываются при дальнейшей обработке.
г) после охлаждения стекла производится окраска препарата простым или сложным методами:
-простыми методами, когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель (водный фуксин Пфейффера или метиленовая синька Леффлера)
-сложными методами, когда определяются клеточные структуры (методы Грама, Циля-Нильсена и др.).
После окраски мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.
Овладение методикой микроскопирования с иммерсионной системой
В начале работы настраивается освещение, для чего необходимо поднять до отказа конденсор, полностью открыть диафрагму и установить плоское зеркало; затем повернуть револьвер и поставить объектив с малым увеличением (х 8), опустить его на расстоянии около 0,5 см от предметного столика. Смотря в окуляр, вращать зеркало до тех пор, пока не установиться предварительное освещение.
Вращая револьвер установить объектив ОИ х 90 и, смотря с боку, осторожно опускать его с помощью макрометрического винта до соприкосновения с маслом.
При микроскопировании обратить внимание на форму (кокки, палочки, извитые), цвет (грамположительные, грамотрицательные, кислотоустойчивые и др.) и расположение бактерий (парами, в цепочку и др.). По окончании работы микроскоп необходимо привести в порядок. Для этого необходимо приподнять тубус микроскопа, снять препарат, вытереть чистой тряпочкой масло с объектива, поставить объектив с малым увеличением, опустить конденсор, полностью открыть диафрагму.
|
|
|
Сложные методы окраски
Окраска мазка по Граму
Метод Грама применяется для выявления грамположительных и грамотрицательных бактерий (рис.1).
| Ход работы 1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты. | Методические указания
Генцианвиалет основная краска.
Раствор Люголя - протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.
Спирт – обесцвечивающий фактор.
Водный фуксин – дополнительная краска. | Ориентировочные данные
Грамположительные бактерии (кокки) синефиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета. |
| 2.Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту. | ||
| 3.Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течении 30 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски. | ||
| 4.Промывают водой. | ||
| 5.Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течении 1-2 минут. | ||
| 6.Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. |
Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать комплекс генцианвиолета с йодом связана со свойствами многослойного пептидогликана. Обработка спиртом вызывает сужение пор пептидогликана и тем самым задерживает краску. Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются и окрашиваются фуксином в красный цвет вследствие меньшего содержания пептидогликана, у них наиболее выражен липополисахаридный слой.
Окраска мазка по Циль-Нильсену
Метод используется для окраски кислотоустойчивых бактерий (M. tuberculosis, M leprae). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества липидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Карболовая кислота разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает тинкториальные свойства, высокая концентрация красителя и нагревание усиливают реакцию взаимодействия клетки с красителями. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет (рис.2 и 3).
Методика окраски:
| Ход работы __________________________ 1.На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают, держа высоко над пламенем до появления паров и каждый раз отставляя препарат в сторону для охлаждения. |
Ориентировочные данные ___________________________ Карболовый фуксин- основная краска; прогревание – протрава.
Наблюдать за появлением паров, глядя на мазок сбоку, а не сверху.
__________________________ Серная кислота - обесцвечивающий фактор.
Синька Леффлера – дополнительная краска.
Кислотоустойчивые бактерии рубиново – красного цвета, а остальная микрофлора – синего цвета. |
| 2.Дают препарату остыть, бумагу сбрасывают и препарат промывают водой. | |
| 3.Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. | |
| 4.Промывают водой. | |
| 5.Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут. | |
| 6.Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией. |
Окраска по Нейссеру
Метод используется для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии (С. diphtheria). В отличие от других коринобактерий у возбудителей дифтерии зерна волютина распалагаются на концах палочек.Этот сложный метод окраски включает несколько этапов:
1) фиксированный мазок окрашивают ацетатом синьки Нейссера
(основная окраска) в течение 2-3 мин.
|
|
|
2) наносят раствора Люголя (протрава) на 10-30 секунд;
3) промывают препарат водой;
4)окрашивают везувином (дополнительная окраска) в теч. 0,5-1 мин.
5) промывают препарат водой, высушить и микроскопируют.
Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис.4).
Окраска по способу Ожешки
Метод Ожешки применяется для выявления спор. Этапы окраски:
1) на нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают на пламени спиртовки 2-3 минуты;
2) кислоту сливают, препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем;
3) окрашивают по Циль-Нильсену.
Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы в синий (рис.5).
