Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений

Данным методом определяют минимальную подавляющую (бактериостатическую) концентрацию антибиотика (МПК) - наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не происходит размножение бактерий и содержимое пробирки остается прозрачным, и минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика (МБК) - наименьшую концентрацию антибиотика, вызывающую полную гибель бактерий.

Методика.

1.В пробирки разливают жидкую питательную среду (МПБ) по 1 мл.

2.Добавляют исследуемый антибиотик в различных разведениях, например, от 1 до 128 ед/мл.

3.Каждому разведению добавляют по 1 мл исследуемой бульонной культуры бактерий.

4. Посевы инкубируют при 37°C в термостате.

5.Учет результатов:

- определение МПК по угнетению роста бактерий;

- для определения МБК дополнительно производят высевы из пробирок с отсутствием видимого роста бактерий на чашки с плотной питательной средой, не содержащей антибиотика. На чашках обозначают концентрацию антибиотика, из который сделан высев.

6. Посевы инкубируют при 37°C в термостате.

7.Определение МБК по отсутствию роста бактерий на плотной питательной среде.

Контрольные вопросы:

1. Дать определение понятиям: стерилизация, дезинфекция.

2. Какие существуют методы стерилизации?

3. В каких случаях для стерилизации используют УФ-лучи?

4. Что такое механическая стерилизация?

5. Химическая стерилизация.

6. Как проконтролировать эффективность стерилизации?

7. Бактериологический контроль эффективности стерилизации.

8. Методы определения антибиотикочусвтвительности бактерий.

6. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника.

Микрофлора толстого кишечника самая многообразная по видовому составу. Облигатные микроорганизмы представлены анаэробными бактериями: бактероидами и бифидумбактериями (96-99%) и факультативными анаэробами:E.сoli, энтерококки, лактобациллы(1-4%).
Транзиторная микрофлора представлена следующими родами: протей, клебсиеллы, клостридии, синегнойная палочка, грибы рода Кандида, простейшие. Также могут присутствовать энтеровирусы.

Микрофлора кишечника играет важную роль в жизнедеятельности человека: участвует в физиологическом воспалении слизистой оболочки и смене эпителия, переваривании и детоксикации метаболитов и т.п.

Значительное влияние оказывает микрофлора кишечника на поддерживание иммунитета, но при снижении сопротивляемости организма могут вызвать гнойно-воспалительные процессы.

Важнейшей функцией нормальной микрофлоры кишечника является ее участие в колонизационной резистентности, что связано способностью представителей нормальной микрофлоры адсорбироваться на поверхности эпителиальных клеток слизистой кишечника, предотвращающих адгезию посторонних микробов; продукцией ряда веществ (молочную, уксусную кислоты, перикиси водорода, бактериоцинов, антибиотиков и др.), оказывающих биостатические и биоицидные действия на патогенные и условно - патогенные микробы, а также с конкуренцией с патогенными бактериями за источника питания.

Дисбактериоз – это количественное и качественное изменение состава нормальной микрофлоры организма человека, возникающее под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антибиотиков, лучевой и химиотерапии. Чаще всего развивается дисбактериоз кишечника.

Для изучения микрофлоры толстого кишечника исследованию подвергают испражнения, которые забирают стерильной палочкой и помещают в пробирку. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 1 часа.

Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника.

Цель. Определение состава фекальной микрофлоры: выделение чистой культуры фекальных микроорганизмов и идентификация.

Исследуемый материал – различные разведения фекалий в физиологическом растворе от 10¹до 10¹¹.

1-й этап. Получение изолированных колоний фекальной микрофлоры.

Ход работы.

1.Делают посевы соответствующих разведений испражнения на среды:

-для выявления анаэробных бифидобактерий необходимо делать посевы фекалий в разведениях от 10⁶до 10¹¹ глубоким уколом в пробирки с полужидкой средой Блаурококка (печеночно-МПА с цистеином и лактозой);

- для выделения E.сoli - на среду Эндо (Левина),

-для выделения патогенных энтеробактерий (сальмонелл, шигелл и др.) – на среду Плоскирева,

-для выделения Proteus vulgaris - посев по Щукеевичу в конденсационную воду скошенного МПА,

-для выделения стафилококков с лецитиназной активностью – на желточно-солевой агар,

-для выделения гемолитических бактерий - на кровяной агар,

-для выделения грибов рода Кандида - на среду Сабуро и др.

2.Все посевы помещают в термостат при 37°С на 18-24 часа, Блаурококка – 48 час., за исключением среды Сабуро (при 28-30°С на 3-5 дней).

2-й этап. Выделение чистой культуры.

Ход работы.

1. Подсчет колоний и макроскопическое описание их:

Выделение чистой культуры бифидобактерий является весьма трудоемким и практически необязательным, так как определение разведения, в котором обнаруживают бифидобактерий является вполне достаточным для оценки нормального или пониженного содержания их в фекалиях. Из посевов, в которых виден рост в виде помутнения всей среды или отдельных колоний, готовят мазки и окрашивают их по Граму. Обнаружение характерных грамположительных палочек с разветвлениями на концах в виде римской цифры V, с несколько утолщенными концами подтверждает их принадлежность к бифидобактериям (рис.24).

-на среде Эндо: определение общего количества E.сoli, подсчет лактозонегативных (бесцветных) и со слабовыраженными ферментативными свойствами (розывые) колоний (рис.25);

-на среде Плоскирева - бесцветных колоний патогенных энтеробактерий (сальмонелл, шигелл и др.);

-на скошенном МПА - рост Proteus vulgaris по всей поверхности;

-на желточно-солевой агаре - лецитиназная активность стафилококков проявляется в виде радужного помутнения вокруг колоний (рис.26);

-на кровяном агаре – колонии бактерий, обладающих гемолитической активностью;

-на среде Сабуро – колонии грибов рода Кандида округлой формы, выпуклые, с гладкой поверхностью, ровными краями, матового цвета. Из подозрительной колонии готовят неокрашенный препарат. При его микроскопии должны быть почкующиеся овальные клетки – псевдомицелии. Окрашиваются по Граму положительно.

2.Микроскопическое исследование колоний.

3.Пересев небольшой части колоний на скошенную среду.

4. Инкубация в термостате при 37°С в течение 18-24 часа.

3-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры.

Ход работы.

1. Макроскопическое определение роста микробов.

2. Проверка на чистоту выделенной чистой культуры – микроскопическое исследование.

3. Окончательная идентификация по ферментативной активности путем пересева на диференциально-диагностические среды и по др. признакам.

4-й этап. Учет результатов идентификации и оформление заключения о наличие и степени дисбактериоза.

Контрольные вопросы:

1.Микрофлора кишечника.

2.Факторы, определяющие состав микрофлоры кишечника.