Выделение генов с помощью ферментов рестрикции

Задачи и методология генетической инженерии.

С начала 1970-х гг., когда появилась первая публикация о получении in vitro рекомбинантной ДНК, возникла новая наука — генная инженерия. Ее основные направления — создание трансгенных животных и растений и разработка принципов генной терапии.

Генетическая инженерия - это комплекс молекулярно-генетических или клеточных методов, которые позволяют создавать нужные (для эксперимента или производства) генетические программы избранных организмов. В том случае, когда манипуляции идут на уровне отдельных генов или на их частях, говорят о генной инженерии.

В зависимости от задач можно указать на следующие уровни приложения методов биотехнологического и общего генетико-инженерного: 1) молекулярный, когда дело касается отдельных частей генов; 2) генный; 3) хромосомный; 4) уровень плазмид; 5) клеточный; 6) тканевый; 7) организменный и 8) популяционный.

Важные результаты были достигнуты при клеточной инженерии эмбриона путем использования чужеродных тотипотентных клеток.

В задачу генетической инженерии входит решение трех основных задач:

1) конструирование функционально активных генетических структур в виде рекомбинантных ДНК, пригодных для переноса в другие клетки;

2) разработка методов введения рекомбинантных ДНК в клетку;

3) создание условий для нормальной экспрессии генов, введенных в данную клетку.

Организмы, полученные в результате внедрения чужеродного генетического материала, называют трансгенными.

Технологии, возникшие на основе методов молекулярной генетики, используются в самых разнообразных областях, таких как диагностика наследственных заболеваний у человека и животных, криминалистика и этнография, производство хозяйственно ценных и биологически активных веществ, получение штаммов микроорганизмов, трансгенных животных и растений с заданными свойствами, клонирование целых организмов, органов или отдельных клеток.

Генетическая инженерия на клеточном, хромосомном уровнях и при помощи суммарной ДНК обеспечивает неконтролируемый во время переноса переход генов от одной клетки к другой. Это касается как всего генома, так и отдельных фрагментов ДНК. Переход отдельных фрагментов устанавливается с помощью слежения за маркерными генами при инкубации клеточных культур на провокационных средах. Методы генной инженерии отличаются тем, что они обеспечивают контролируемое внедрение индивидуальных избранных генов. Эти методы основываются на возможностях выделения отдельных генов и затем их внедрения в клетку реципиента, в первую очередь с помощью гибридных молекул — векторов.

Методы выделения и синтеза генов.

Имеется ряд способов выделения генов. Среди них основными являются: 1) ферментативный синтез генов; 2) химический синтез генов; 3) выделение генов с помощью ферментов рестрикции.

Ферментативный синтез гена

В пробирке происходит транскрибирование нити ДНК на молекулах иРНК от данного индивидуального гена, который выделяется из клетки. Возможность такого синтеза появилась после обнаружения Г. Теминым, С. Мизутани и Д. Балтимором в 1970 г. фермента обратной транскриптазы. При наличии этого фермента происходит транскрибирование молекул ДНК с матриц молекул иРНК.

Синтезированные гены, полученные с помощью обратной транскриптазы, не имеют в своем составе регуляторных частей (промотора и др.) и не содержат модифицированных оснований, в результате чего они функционально неактивны. Поэтому желательно иметь матрицы РНК не только со структурными, но и с регуляторными частями генов в виде так называемой про-мРНК. С помощью ферментативного синтеза получены гены, кодирующие глобины человека„ мыши, кролика, утки, голубя, белок хрусталика быка, гены вируса осповакцины и др.

Химический синтез генов

В 1969 г. Г. Корана и сотрудники впервые осуществили химический синтез гена, кодирующего транспортную аланиновую рибонуклеиновую кислоту (тРНК) в клетках пекарских дрожжей.

Процедура химического синтеза аланинового гена тРНК имела две стадии.

1. Получение двунитевых фрагментов из дезоксиолигонуклеотидов, которые в качестве блоков были необходимы для построения всей молекулы.

2. Слияние фрагментов в двойную непрерывную цепь ДНК с помощью Т₄-полинуклеотидлигазы.

Химически синтезированный ген, кодирующий аланиновую тРНК, отличался от нативных генов своей неспособностью работать in vitro, с него не считывается молекула РНК. Причиной этого служит то, что были синтезированы только структурные части гена. Ни промотора, ни терминальных кодонов не было в химически синтезированном гене аланиновой тРНК.

Выделение генов с помощью ферментов рестрикции.

В конце 70-х годов были предложены методы секвенирования, под которыми подразумевается определение первичной структуры ДНК. Главное значение имеют два метода. В 1977 г. А. Максам и Ф. Гильберт предложили метод деградации ДНК, в 1980 г. Ф. Сэнджер — метод полимеразного копирования с использованием терминирующих аналогов нуклеотидов. Эти методы секвенирования позволяют определять непрерывную последовательность нуклеотидов во фрагменте, содержащем не более 500 оснований. Таким образом необходимо иметь фрагменты ДНК и использовать метод электрофореза в пoлиакриламидных гелях, чтобы разделять олигонуклеотиды, различающиеся в длину на один нуклеотид.

Молекулы ДНК разбиваются на фрагменты под влиянием разных агентов, в частности при действии ультразвука. Получение из суммарной ДНК фрагментов разнообразного, непредсказуемого размера получило название способа дробового ружья (shot-gun). Фрагменты, возникающие при действии на ДНК ферментов рестрикции, поскольку разные рестриктазы узнают разные последовательности в ДНК, имеют вполне определенный характер. При локализации участков узнавания за границами гена он может быть вырезан целиком в составе малого фрагмента. В том случае, когда места узнавания находятся внутри гена, рестриктазы дробят ген, выделяя части в виде отдельных фрагментов. Рестриктазный анализ в сочетании с прочтением нуклеотидной последовательности, при сопоставлении этой последовательности с последовательностью нуклеотидов в зрелых молекулах иРНК, транскрибируемых с данного гена, послужил орудием для выяснения строения генов эукариот.

Существенной особенностью фрагментов, полученных с помощью рестриктаз, является наличие у них липких концов. Это обеспечивает им возможность соединяться с липкими концами других молекул. При получении фрагментов в целях секвенирования ДНК нужна ее рестрикционная карта, по которой узнаются места положения разрезов ДНК и длина вырезаемых фрагментов.

Улучшение методов секвенирования связано с использованием клонирования фрагментов в рекомбинантных молекулах, с получением смеси фрагментов с помощью ультразвука или ДНКазы I, действие которых имеет неспецифический характер. В этом случае осуществляется слепое секвенирование, которое является самым быстрым и пригодным для секвенирования протяженных областей ДНК. Его осуществление требует применения ЭВМ.