Современные лабораторные методы

МИКРОАНАЛИЗА

Последние два-три десятилетия ознаменовались бурным развитием лабораторных технологий. На смену традиционным серологическим методам лабораторного анализа, таким как реакция связывания комплемента (РСК), реакция гемагглютинации (РГА, РНГА), реакция преципитации, пришли иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммунологический анализ (РИА). С последними успешно конкурирует электрохемилюминесцентный метод, широко используемый в Западной Европе и в ряде медицинских центров России. С культуральными и бактериологическими методами соперничает внедренный в последнее десятилетие в клиническую практику молекулярно-генетический метод – цепная полимеразная реакция (ПЦР). Отличительным признаком современных лабораторных методов является высокая чувствительность – способность обнаруживать минимальные концентрации тестируемого вещества, в связи с чем эти методы причислены к разряду микроаналитических.

РИА разработан в 1960 г. и по сей день является одним из наиболее распространенных методов микроанализа. Основным условием проведения РИА является возможность проведения реакции антиген-антитело, в ходе которой устанавливается равновесие между свободным и связанным антигеном. Для того чтобы происходило конкурентное связывание, должна существовать определенная степень между меченым (радиоактивным I¹²⁵, испускающим гамма-излучение) и немеченым антигеном (исследуемым аналитом, например гормоном, содержащимся в исследуемой сыворотке). Меченые и немеченые антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания. Количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Преимуществами РИА перед другими методами являются высокая чувствительность, воспроизводимость и точность из-за более высокой точности приборов, регистрирующих гамма-излучение. Кроме того, в РИА объем инкубационной среды (обычно порядка 0,5 мл) почти всегда больше, чем в ИФА (обычно порядка 0,2 мл, что связано с ограниченным объемом лунки микропланшета), а точность пипетирования больших объемов жидкостей, как известно, более высокая. Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и существенные недостатки:

1) возможность радиоактивного загрязнения окружающей среды;

2) короткий срок жизни радиоактивной метки (у I¹²⁵ – 60 дн.);

3) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности.

РИА используют в клинической практике и научных приложениях для определения концентрации гормонов, онкомаркеров, различных антител (IgE и специфических противоинфекционных) и биологически активных веществ в сыворотке крови,    а также содержания лекарственных веществ (например, для мониторинга циклоспорина А) в организме.

ИФА (в английской транскрипции ELISA) является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА-системах высокая стабильность реагентов сочетается с простотой методов регистрации реакции, а также с доступностью и широким выбором коммерческих тест-систем. ИФА основан на том же принципе, что и РИА. Основным отличием является то, что вместо радиоактивной метки применяется ферментная. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты эффективно осуществляют наработку легко выявляемого вещества, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10¹² М). По превращению субстрата (перекиси водорода) ферментом (пероксидазой) можно судить о количестве вступившего во взаимодействие комплекса антиген-антитело. Область применения ИФА соответствует РИА. Преимущество ИФА: экологически чистый метод, стабильность конъюгатов увеличивает срок годности набора, результаты исследования можно оценивать полуколичественно, т.е. без применения дорогостоящей аппаратуры. Так как в ИФА всегда больше, чем в РИА, количество промывок, а также две дополнительные стадии – внесение субстратного реагента и остановка ферментативной реакции, то эта процедура несколько сложнее. Кроме того, ошибки пипетирования, объективно существующие на каждом из этапов внесения компонентов, суммируются и ухудшают воспроизводимость и точность анализа. Зависимость ферментативной реакции от температуры, времени, рН, качества воды, попадания прямого света является фактором риска при постановке ИФА. Кроме того, ИФА отличает наиболее узкий диапазон определяемых концентраций за счет используемой для регистрации результатов аппаратуры (измерения на фотометрах ограничены 2 ед. оптической плотности).

С внедрением ПЦР (ДНК-диагностики) в медицинскую практику диагностика инфекционных заболеваний перешла на качественно новый уровень. ПЦР направлена на обнаружение самого возбудителя инфекции по генетическому материалу – ДНК или РНК, в то время как серологические методы (например, ИФА) определяют лишь антитела к инфекционному агенту. ПЦР – прямой метод детекции микроорганизма, а серологические способы – косвенные. ПЦР-метод не может быть использован как скрининговый из-за трудоемкости исследований, необходимости особой материально-технической базы. ПЦР используется для диагностики инфекций в следующих случаях:

1. Ранняя диагностика инфекций. В течении любой инфекции имеется «серологическое окно» – период, предшествующий появлению антител. Для вирусного гепатита С «серологическое окно» – 82 дн. (в этот период ИФА и другие серологические методы не обнаруживают инфекцию), а РНК вируса в плазме крови выявляется ПЦР-методом в среднем с 11-го дн. Антитела к ВИЧ появляются через 23-28 дн. от момента заражения, а детекция РНК вируса возможна на 10-11-й дн.

2. Диагностика латентных форм инфекционных заболеваний, а также на поздних стадиях хронических инфекций, когда из-за истощения иммунного ответа обнаруживаются низкие титры антител, не улавливаемые ИФА. Например, в терминальной стадии СПИДа не обнаруживаются ВИЧ-антитела, в то время как ПЦР выявляет РНК вируса.

3. Контроль эффективности этиотропного лечения, в частности противовирусной терапии. Исчезновение вирусной ДНК или РНК в процессе лечения является одним из критериев эффективности использования противовирусных препаратов. Так, при вирусном гепатите С антитела сохраняются после элиминации вируса в течение 4-8 и более лет. В связи с этим присутствие антител не всегда говорит о присутствии вируса и не позволяет судить об активности процесса.

4. Определение генотипа вирусов. Генотип определяет течение, прогноз заболевания. Установлено, что у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С генотипа 1b, заболевание имеет более прогрессивное течение, быстро приводит к циррозу, и такие больные хуже отвечают на противовирусную терапию интерфероном. ПЦР применяют для диагностики не только инфекционных заболеваний, но и наследственных.

Сущность иммунохемилюминесцентного метода в том, что определяемое вещество взаимодействует со специфическими антителами, фиксированными с помощью биотин-стрептовидина к микромагнитным частичкам. Вторые антитела мечены солями рутения. При взаимодействии аналита с антителами от возбужденного рутения передается сигнал на трипропиламин, при этом испускается фотон, преобразуемый в электрический сигнал. Рассматриваемый метод используется для определения гормонов, онкомаркеров, диагностики инфекций и анемии (определение концентрации витамина В12, фолиевой кислоты), ранней диагностики инфаркта миокарда (определение тропонина I и T). Главным недостатком аналитических систем с использованием флюоресценции является их ориентация на закрытые автоматические анализаторы. Как было показано для стран Западной Европы, стоимость одного определения на анализаторе в среднем в 2 раза выше, чем для РИА-анализа.

Рассмотренные методы микроанализа можно использовать в различных областях медицины – для диагностики инфекционных заболеваний, в эндокринологии с целью определения гормонов, в онкологии для определения онкомаркеров, в гематологии для диагностики анемий, в кардиологии при определении маркеров инфаркта миокарда. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, что определяет целесообразность «специализации» этих методов на определенные исследования. Однако в связи с низким уровнем материально-технической базы здравоохранения в России и странах Восточной Европы зачастую один и тот же метод используется в различных приложениях. Иная ситуация в высокоразвитых странах. Так, в тех областях, где требуется высокая чувствительность и точность метода, широкий диапазон определяемых концентраций (при определении концентрации гормонов, ферритина, циклоспо-рина А, онкомаркеров), используют преимущественно РИА. Там, где требуется проведение массовых серийных исследований скринингового (возможно, полуколичественного) характера, не требующих большой точности и чувствительности (диагностика инфекций, определение IgE, интерлейкинов, антинуклеарных антител), предпочтение отдается ИФА-методу. Для диагностики инфекций в инкубационном периоде, в терминальной стадии, при их латентном течении, а также с целью оценки эффективности этиотропного лечения проводится ПЦР. Иммунохемилюминесцентный анализ является методом выбора при необходимости единичных исследований, в экспресс-диагностике.

В клинической иммунологии наиболее широко используется метод ИФА, отдельные этапы которого рассмотрим на примере определения IgE.