2020-10-11
206
Одним из важных физиологических свойств микроорганизмов является способность синтезировать различные биологически значимые соединения. Среди них антибиотики. Термин «антибиотик», предложенный С. А. Ваксманом в 1942 году, используют для определения веществ, образуемых микроорганизмами и обладающих антимикробным действием. Вместе с тем, разные авторы по-разному определяют этот термин. По мнению З. В. Ермольевой (1946) и других, антибиотиками следует называть продукты обмена любых организмов, способные избирательно убивать микроорганизмы или подавлять их рост. С. М. Навашин И. П. Фомина антибиотиками называют химиотерапевтические вещества, образуемые микроорганизмами или полученные из иных природных источников, а также их производные и синтетические продукты, обладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболевания или задерживать развитие злокачественных опухолей.
Очевидно, что недостатка в определениях нет. Мы полагаем, что на первом этапе знакомства нас устроит такое: антибиотики – это вещества подавляющие или полностью прекращающие рост и развитие микроорганизмов.
|
|
|
Классификация антибиотиков основана на разных свойствах этих веществ.
Их можно различать по источнику происхождения:
- естественные
- искусственные.
Продуцентами естественных антибиотиков могут выступать организмы самых разных групп:
бактерии - полимиксины (Bacillus polymyxa), грамицидин (Bacillus brevis), левомицетин (Streptococcus venezuelae) и др.
актиномицеты – неомицин, канамицин, мономицин, стрептомицин, нистатин и др. (p. Streptomyces);
грибы – пеницилин, гризеофульвин (р.Penicillium);
растения – аллицины (лук, чеснок);
животные – лизоцим.
Антибиотики можно дифференцировать на основании их химической структуры:
- b - лактамные (пенициллины)
- тетрациклины (тетрациклин, олететрин, метациклин);
- макролиды (эритромицин, олеандомицин, линкомицин);
- аминогликозиды (сизомицин, гентамицин, канамицин);
- пептиды (полимиксины, грамицидин).
Широкое применение в практике приобрела классификация антибиотиков по спектру действия:
- широкого спектра действия,
- действующие на грамположительные микробы,
- действующие на грамотрицательные бактерии.
В связи с распространением антибиотикорезистентности бактерий особый интерес представляет разделение антибиотиков по механизму действия на бактериальную клетку:
- подавляющие синтез пептидогликана;
- подавляющие синтез нуклеиновых кислот;
- ингибиторы синтеза белка;
- нарушающие физиологическую активность микроорганизмов.
|
|
|
Существуют и другие принципы классификации, с которыми можно познакомится в специальной литературе (Л. Е. Бриан, 1984; Н.С. Егоров, 1994)
Упоминавшаяся выше антибиотикорезистентность микроорганизмов вызвала к жизни процедуры контроля за этим свойством у клинически значимых штаммов микробов. Сегодня для успешной борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителя необходимо четко знать их антибиотикограммы – картину чувствительности возбудителя к разным антибиотикам. Обнаружить чувствительность можно разными методами, среди которых для нас наиболее доступным, хотя и не самым репрезентативным, является метод бумажных дисков.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ
При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя и лишь при необходимости срочного получения ответа используют смешанные культуры, содержащие всю микрофлору, имевшуюся в исследуемом материале.
Наиболее прост и доступен метод определения чувствительности с помощью дисков, пропитанных антибиотиками (ДИСКО-ДИФФУЗИОННЫЙ МЕТОД). В стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, разливают по 15 мл. плотной питательной среды (чаще всего 2% мясопептонный агар). На поверхность застывшего и слегка подсушенного агара наливают 1 мл суспензии суточной культуры микроба-возбудителя или, если чистая культура не выделена, взятого для исследования патологического материала (гной, экссудат и т. п.), слегка разведенного изотоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную взвесь равномерно распределяют по поверхности агара, а ее избыток удаляют пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками — по 5—6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки.
Чашки выдерживают при 37°С 16—18 ч, после чего учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Размер зон зависит от степени чувствительности возбудителя к данному антибиотику. При зоне диаметром до 10 мм штамм расценивается как устойчивый, 11— 15 мм —как малочувствительный, 15—25 мм—как чувствительный. Зоны, превышающие 25 мм, свидетельствуют о высокой чувствительности микроорганизма к данному антибиотику. Однако этот метод нельзя считать количественным.
Более точные результаты можно получить, применяя метод серийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД. в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 2 мл из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой пробирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для постановки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикетке которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500000 ЕД. пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД. при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД./мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД./мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл. полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД./мл., во второй — 25 ЕД./мл. и т. д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г. активного вещества соответствует 1000000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.
|
|
|
Если порошок антибиотика расфасован не мерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20—25 мг.), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т. е. получить раствор мг./мл., в 1 мл. которого содержится столько единиц, сколькоихбыло указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив густоту взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0, 2 мл. вносят во все пробирки ряда, начиная с контрольной. Таким образом, во всех пробирках содержится в 1 мл. 1060 микроорганизмов. Результаты опыта учитывают после инкубации при 37°С в течение 18—20 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную, подавляющую рост данного микроорганизма концентрацию антибиотика.
Для определения чувствительности микробов к сульфаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески препарата. Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к антибиотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят определенное разведение изучаемого препарата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 18—20 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если последние чувствительны к данному препарату.
Выделение и практическое использование веществ антибиотической природы основано на взаимоотношениях между микроорганизмами разных видов.
В настоящее время обнаружены также антимикробные вещества, действующие внутри одного вида, что и отличаетих от антибиотиков.
|
|
|
ЗАНЯТИЕ 7а. Нормальная микрофлора тела человека.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Приготовление препаратов зубного налета: фиксированного и нативного(раздавленная капля).
2. Взятие пробы микрофлоры поверхности тела методом смыва. Посев на МПА методом отпечатков.
ЗАНЯТИЕ 8. Физиологические группы микробов. Синтетические среды их приготовление. Круговорот азота. Процессы азотфиксации, аммонификации, нитрификации, денитрификации.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Приготовление и просмотр препаратов микроорганизмов выделенных из проб с поверхности тела.
2. Приготовление накопительных сред для нитрифицирующих и денитрифицирующих микроорганизмов.
3. Приготовление элективной среды Эшби для выделения азотфиксаторов.
Микроорганизмы вступают в самые различные взаимоотношения как с другими группами организмов, так и между собой. Одним из таких типов взаимоотношений характерных для микробов является МЕТАБИОЗ. Такой тип взаимоотношений предполагает последовательное использование продуктов жизнедеятельности одних видов другими. В результате микроорганизмы образуют сложные ассоциации, последовательно утилизирующие сложные органические субстраты Наглядным примером такой ассоциации являются микробы участвующие в процессах превращения соединений азота. Эта группа микроорганизмов интересна и своей важнейшей биосферной ролью.
Азот – один из главных компонентов атмосферы. Все организмы так или иначе соприкасающиеся с воздухом, соприкасаются и с азотом. Вместе с тем растения постоянно испытывают недостаток минерального азота, что затрудняет синтез новых клеточных структур, прежде всего белковой природы. Несмотря на бескрайние запасы молекулярного азота в атмосфере, растениям доступен лишь связанный азот почвы.
КРУГОВОРОТ АЗОТА
Рис. 21. Круговорот азота. Окисление азота показано сплошными стрелками, восстановление — точечными, а реакции без изменения валентности — пунктирными стрелками.
РИСУНОК 21
Связанный азот в форме аммиака, нитрата и органических соединений относительно дефицитен в почве и воде и часто представляет собой фактор, ограничивающий развитие живых организмов. По этой причине циклическое превращение азотистых соединений играет первостепенную роль в снабжении необходимыми формами азота различных по пищевым потребностям организмов биосферы. Основные этапы циклического превращения азота схематически показаны на рис.21.
ФИКСАЦИЯ АЗОТА
Подсчитано, что количество азота, участвующего в круговороте, составляет 108—109 т в год. Тот факт, что в атмосфере имеется неисчерпаемый запас газообразного азота (N2), тогда как на земной поверхности наблюдается относительный дефицит связанного азота, позволяет предположить, что этапом, ограничивающим скорость круговорота, является процесс фиксации азота. Это в основном биологический процесс, и единственными организмами, способными его осуществлять, являются бактерии. Некоторое количество азота фиксируется при грозовых разрядах, под действием ультрафиолетовых лучей, при работе электрического оборудования и двигателей внутреннего сгорания; однако небиологические процессы такого рода несущественны в количественном отношении, так как все вместе они дают не более 0, 5% всего фиксированного азота. Даже вклад промышленного производства азотных удобрений по методу Хабера составляет лишь около 5%. Таким образом, свыше 90% общей фиксации азота обусловлено метаболической активностью определенных бактерий.
Биологическая фиксация азота в природе осуществляется частично свободноживущими бактериями (несимбиотическая фиксация азота), а частично бактериями, существующими в сообществе с растениями (симбиотическая фиксация азота).
Наиболее важными и изученными микроорганизмами, способными к симбиотической фиксации азота, являются бактерии рода Rhizоbium, внедряющиеся в корневые волоски бобовых растений и развивающиеся в образованных на корнях клубеньках, где и происходит фиксация азота. Ферментативный аппарат для фиксации азота синтезируется бактерией; растение-хозяин обеспечивает условия, благоприятствующие проявлению этого свойства.
К наиболее важным микроорганизмам, осуществляющим несимбиотическую фиксацию азота, относятся цианобактерии, образующие гетероцисты, такие, как Аnabаеnа и Nostoc. К. фиксации азота способен также целый ряд других как аэробных (Azotobacfer, Beijerinckia и Bacillus polymyxa), так и анаэробных бактерий (фотосинтезирующие бактерии и Clostridium spp.).
Определение количества фиксированного азота в расчете на один гектар в год (табл.) показывает, что вклад симбиотических клубеньковых бактерий значительно превышает вклад несимбиотических азотфиксаторов. Однако надо учитывать тот факт, что исследования проводились in vitro. По мнению некоторых авторов, вклад этих бактерий значительно больший, если они обитают в ризосфере растений.
Биологическая фиксация азота стала предметом интенсивного исследования, чему способствовала значимость этого процесса в снабжении растений адекватным количеством азота.
Эффективность некоторых азотфиксирующих систем в кг./га за вегетативный период
Симбиотические
Люцерна: Rhizobium >296
Клевер: Rhizobium 247
Люпин: Rhizobium 148
Несимбиотические
Цианобактерии 25
Azotobacter spp 0, 29
Clostrldium pasteurianum 0, 25
(Из книги Е Н Мишустина и В К Шильниковой (Mishustin E. N., Shilnikovа V. К., Biological Fixation of Atmospheric Nitrogen, London, Macmillan, 1971).
Важной целью этих исследований является выведение новых растений, способных служить хозяевами для азотфиксирующих симбионтов. Современный список таких растений хотя и широк, но не включает ни главные пищевые сельскохозяйственные культуры — пшеницу и рис, ни основные фуражные культуры злаков. Большое внимание сейчас привлекают бактерии, обитающие в ризосфере злаков, названные Azospirillum, которые способны фиксировать N2.
ПРЕВРАЩЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО АЗОТА И ОБРАЗОВАНИЕ АММИАКА
Органические азотистые соединения, синтезируемые водорослями и растениями, служат источниками азота для животных. Сложные азотистые соединения растений в процессе их ассимиляции животными в большей или меньшей степени гидролизуются, однако, азот остается в основном в восстановленной органической форме. Тем не менее, животные в отличие от растений в процессе метаболизма выделяют значительное количество азотистых соединений. Форма, в которой выделяется этот азот, варьирует от одной группы животных к другой. Беспозвоночные выделяют преимущественно аммиак, но у позвоночных наблюдается выделение и органических азотистых продуктов; у пресмыкающихся и птиц основное выделяемое азотсодержащее соединение — это мочевая кислота, а у млекопитающих — мочевина. Выделяемые животными мочевина и мочевая кислота быстро минерализуются особыми группами микроорганизмов с образованием СО2 и аммиака.
Только часть азота, запасенного в органических соединениях в процессе роста растений, превращается в аммиак в результате обмена веществ у животных, а также при микробном разложении мочевины и мочевой кислоты. Значительное его количество сохраняется в растительных и животных тканях и освобождается лишь после смерти этих организмов. Когда умирает растение или животное, компоненты его тела немедленно подвергаются действию микроорганизмов, и азотистые соединения разрушаются с образованием аммиака. Часть азота ассимилируется самими микроорганизмами и таким образом превращается в компоненты микробной клетки. В конечном счете, и эти компоненты переходят в аммиак после отмирания микробов.
Первый этап этого процесса аммонификации — гидролиз белков и нуклеиновых кислот с освобождением соответственно аминокислот и органических азотистых оснований, более простых соединений, которые затем также расщепляются в результате дыхания и брожения.
Разрушение белка в анаэробных условиях (гниение) обычно не приводит к немедленному освобождению всего аминного азота в виде аммиака. Некоторые аминокислоты превращаются в амины. Гнилостное разложение характерно для деятельности анаэробных спорообразующих бактерий (рода Clostridium). В присутствии воздуха амины окисляются другими бактериями с выделением аммиака.
Водоросли и растения ассимилируют азот в виде нитрата или аммиака. Если ассимилируемой формой является нитрат, то он должен быть восстановлен в клетке до аммиака. Количество восстановленного нитрата соответствует такому количеству азота, которое требуется для роста данного организма; аммиак при этом не выделяется. Именно такая особенность отличает ассимиляцию нитрата растениями (а также микроорганизмами) от восстановления нитрата (нитратредукции) — процесса анаэробного дыхания, существующего только у прокариот (рис. 21).
НИТРИФИКАЦИЯ
В процессе всех превращений, которым подвергается азот с момента его ассимиляции растениями до его освобождения в виде аммиака, атом азота остается в восстановленной форме. Превращение аммиака в нитрат (нитрификация) осуществляется в природе двумя высокоспециализированными группами облигатно аэробных хемоавтотрофных бактерий. Нитрификация происходит в два этапа: на первом аммиак окисляется до нитрита, на втором нитрит окисляется до нитрата. В результате совместной деятельности этих бактерий аммиак, освобождающийся в процессе минерализации органического вещества, быстро окисляется в нитрат. Таким образом, нитрат—основное азотистое вещество почвы, используемое растениями в процессе роста. Практика удобрения почвы навозом основана на микробной минерализации органического вещества, которая приводит к превращению органического азота в нитраты путем аммонификации и нитрификации. Еще более простым способом повышения содержания нитратов в почве служит орошение полей разбавленными растворами аммиака, что является одним из современных методов удобрения почв. Аммиак, который можно синтезировать химическим путем из молекулярного азота,—это наиболее концентрированная форма доступного связанного азота, поскольку он содержит около 82% азота по весу. Нитраты представляют собой весьма растворимые соединения, поэтому они легко выщелачиваются из почвы и уносятся водой; следовательно, определенное количество связанного азота постоянно удаляется с континентов и переносится в океаны. В некоторых местностях, особенно в полузасушливых районах Чили, в почве накапливаются отложения нитратов в результате выхода и испарения поверхностных вод.
Такие отложения — ценный источник удобрения, хотя их значение существенно снизилось за последние 50 лет вследствие развития химических методов производства азотистых соединений из атмосферного азота.
ДЕНИТРИФИКАЦИЯ
В анаэробных условиях многие аэробные бактерии вместо кислорода могут использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов.
Таким образом, всякий раз, когда при разложении органического вещества в почве или воде кислород исчерпывается в результате дыхания аэробных микроорганизмов, некоторые из этих аэробов в присутствии нитрата продолжают дышать за счет органического вещества, т. е. переходят к анаэробному дыханию. При этом происходит восстановление нитратов. Некоторые бактерии (например, Escherichia coli) способны восстанавливать нитрат только до уровня нитрита, другие (например, Pseudomonas aeruginosa) могут восстановить его до газообразного азота. В ходе этого процесса, называемого денитрификацией, связанный азот удаляется из почвы и воды с освобождением газообразного N2 в атмосферу.
Денитрификация — процесс, имеющий большое экологическое значение. Он лишает почву необходимого для растений азота, снижая за счет этого продуктивность сельского хозяйства. Особенно значительные потери происходят в удобренных почвах. Хотя точные цифры не известны, но при определенных условиях удобрения могут утрачивать в результате денитрификации до 50% связанного азота.
Тем не менее, денитрификация приводит не только к вредным последствиям. Благодаря денитрификации в почве всегда имеется определенное количество связанного азота. Хорошо растворимые ионы нитрата постоянно выщелачиваются из почвы и, в конечном счете, переносятся в океаны. При отсутствии денитрификации земной запас азота, включая N2 атмосферы, в конце концов, сосредоточился бы в океанах, и жизнь стала бы невозможной на основной части суши, за исключением прибрежной полосы. Денитрификация делает пресную воду пригодной для питья, поскольку высокие концентрации ионов нитрата являются токсичными.
Сказанное выше показывает взаимную зависимость микроорганизмов – участников превращений соединений азота. Азотфиксаторы синтезируя азотсодержащую органику создают субстрат для жизнедеятельности аммонификаторов. Те, в свою очередь, утилизируя органические азотсодержащие соединения и продуцируя аммиак, создают условия для деятельности нитрификаторов. А нитриты и нитраты являются исходным субстратом в процессе денитрификации. Процесс денитрификации в свою очередь определяет как концентрацию аммиака в среде обитания микробов, так и концентрацию нитритов и нитратов.
Выделить и изучить микроорганизмы, участвующие в превращениях соединений азота можно используя специальные среды, среди которых накопительные и элективные.
Так для выделения азотфиксаторов используют элективную среду Эшби. В её составе отсутствует азот, в какой бы то ни было форме.
Среда Эшби (рецепт в г/л дистиллированной воды)
маннит, или глюкоза, или сахароза 20
К2НРО4 0.2
MgSO4 0.2
NaCl 0.2
K2SO4 0.1
CaCO3 5.0
Среду стерилизуют при одной атмосфере – основу, и затем добавив углевод стерилизуют еще раз при 0.5 атм. Для получения плотной среды Эшби её уплотняют агар – агаром и разливают в чашки. На поверхность среды раскладывают комочки почвы. Как правило вокруг комков можно обнаружить слизистые прозрачные колонии бактерий Azotobacter. Подробнее методы выделения азотфиксаторов смотрите в руководствах приведенных в списке литературы.
Для выделения нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий используют синтетические накопительные среды следующего состава.
Для нитрификаторов (среда Виноградского) первой стадии в г/л дистиллированной воды:
(NH4)2SO4 2.0
K2HPO4 1.0
MgSO4 0.5
NaCl 2.0
FeSO4 0.4
CaCO3 5.0
Для нитрификаторов второй стадии:
NaNO2 1.0
Na2CO3 1.0
NaCl 0.5
K2HPO4 0.5
MgSO4 0.5
FeSO4 0.4
CaCO3 5.0
Среды стерилизуют 20 мин. при 1 атм.
Для денитрификаторов готовят среду Гильтея (в г/50 мл. дистиллированной воды):
KNO2 0.4
аспарагин 0.2
KH2PO4 0.2
MgSO4 2.0
CaCl2 0.2
FeCl3 следы
натрий лимоннокислый 5.0
Раствор доводят до 1000 мл. и устанавливают рН 7.0. Стерилизуют при 0.5 атм. в течение 20 минут.
Аммонификаторы успешно растут на средах содержащих МПБ.
Все названные среды заражают почвой.
ЗАНЯТИЕ 9. Участие микроорганизмов в процессах превращения соединений углерода
ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1. Приготовление препаратов из накопительных культур нитрифицирующих, денитрифицирующих и азотфиксирующих бактерий.
2. Приготовление препаратов молочнокислых бактерий из различных субстратов: квашеная капуста, силос, молочнокислые продукты и др.
3. Приготовление препаратов клеток возбудителей спиртового брожения.
Среди процессов минерализации брожения занимают одно из важных мест. Анаэробная и аэробная деструкция органики осуществляется самыми разнообразными микроорганизмами. Интерес к этим микробам определяется не только их ролью в круговороте углерода, но в большинстве случаев они привлекают внимание человека как продуценты многих биологически активных соединений. Ярким примером такой группы микроорганизмов могут служить молочнокислые бактерии.
Биохимия процесса сбраживания углеводов хорошо изучена и приведена в учебниках. Мы ограничимся лишь краткой схемой этого процесса с небольшими пояснениями. (См. рис.23)
РИСУНОК 23 гликолиз
Термин гликолиз означает анаэробное разрушение глюкозы. Процесс включает следующие основные этапы:
1. Превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат.
2. Превращение глюкозо-6-фосфата в два продукта, содержащих по три углеродных атома и способных к дальнейшему окислению.
3. Окисление глицеральдегид-3-фосфата до 3-фосфоглицериновой кислоты (анаэробное фосфорилирование). На этой стадии образуется 2 молекулы АТР в расчете на 1 молекулу глюкозы,
4. Образование пирувата сопровождается синтезом еще одной молекулы АТР (2 молекулы АТР на молекулу глюкозы).
5. Превращение пирувата в лактат - заключительный этап гликолиза.
В аэробных условиях образования лактата не происходит; в присутствии кислорода декарбоксилирование пирувата приводит к образованию ацетил-СоА, который превращается далее в цикле трикарбоновых кислот. Восстановленный NADH вновь окисляется в процессе работы дыхательной цепи
Наряду с образованием значительных количеств молочной кислоты, играющей немаловажную роль в физиологии многих макроорганизмов, молочнокислые образуют целый букет соединений – предшественников, утилизируемых эукариотическими клетками.
Немаловажна в связи с этим роль молочнокислых бактерий в функционировании микробного ценоза кишечника у многих высших животных, включая и человека. С деятельностью вышеназванных микроорганизмов связывают многие процессы протекающие в организме человека как физиологически адекватные, так и патологические. Об этом, в частности, может свидетельствовать огромный сегодняшний интерес к молочнокислым продуктам питания.
Роль микроорганизмов в превращениях органических веществ была осознана только в середине XIX в., хотя человек с доисторических времен использовал процессы, протекающие с участием микробов, для приготовления пищи, напитков и тканей. Во многих случаях человек научился управлять этими процессами и значительно усовершенствовал их с помощью чисто эмпирических методов. Самые известные примеры процессов, протекающих с участием микробов, — производство пива и вина, закваска некоторых растительных продуктов, приготовление хлеба, уксуса, сыра и масла, вымачивание льна. Культуры этих редуцентов достаточно просто получить в лабораториях, используя принцип накопительных сред. Так, например, деструкторы пектина и целлюлозы успешно развиваются в колбе с водой, куда помещен небольшой снопик соломы и почва. Разные молочнокислые бактерии развиваются при заквашивании растительной массы, обычном скисании молока. "Дикие" расы дрожжевых клеток развиваются в процессах приготовления домашнего вина. Накопительные культуры служат прекрасным материалом для выделения чистых культур и приготовления препаратов для микроскопирования.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Молочнокислые бактерии образуют большое количество молочной кислоты из сахара. Это приводит к снижению рН среды, в которой они росли, и предотвращает развитие большинства других микроорганизмов. В результате этого в среде обычно развиваются лишь кислотоустойчивые микробы, как правило, формирующие особую среду и продукты.
При изготовлении таких молочных продуктов, как масло, сыр и йогурт, используются различные микроорганизмы, но наиболее широко — молочнокислые бактерии. Осознание роли, которую играют микроорганизмы в получении этих продуктов, привело к развитию особой ветви микробиологии — микробиологии молока и молочных продуктов.
Многие молочнокислые бактерии изначально присутствуют в молоке и вызывают его спонтанное скисание. Заквашивание молока представляет собой своеобразный способ консервации этого весьма скоропортящегося в обычных условиях продукта, и изготовление сыра и других продуктов путем створаживания молока, несомненно, возникло как способ его консервации.
Производство сыров состоит из двух основных этапов:
створаживания белков молока, образующих твердый осадок, из которого удаляется жидкость,
созревания творога под действием различных бактерий и грибов (хотя некоторые сыры почти не проходят стадию созревания).
Процесс створаживания может быть чисто микробиологическим, так как кислоты, образуемой молочнокислыми бактериями, достаточно для свертывания молочных белков. Однако часто для этой цели используется фермент, названный реннином (его выделяют из желудка телят).
Последующее созревание творога — очень сложный процесс, особенности его зависят от того, какой сорт сыра хотят получить. Процессы созревания в химическом отношении весьма многообразны. В молодом сыре весь азот входит в состав нерастворимого белка, но по мере созревания сыра белок расщепляется на растворимые пептиды и, в конце концов, — на свободные аминокислоты. Далее аминокислоты могут расщепляться с образованием аммиака, жирных кислот и аминов. Определенный вклад в процесс созревания вносят ферменты, присутствующие в препарате реннина, но основную роль играют ферменты бактериального происхождения, содержащиеся в сыре. Твердые сыры созревают главным образом под действием молочнокислых бактерий, которые растут в сырой массе, гибнут, подвергаются автолизу и высвобождают гидролитические ферменты. Мягкие сыры созревают под действием ферментов дрожжей и других грибов, растущих на поверхности.
Некоторые микроорганизмы играют весьма специфическую роль в созревании определенных сортов сыра. Синяя или зеленоватая окраска и неповторимый вкус рокфора обусловлены ростом в толще сыра синей плесени Penicillium roqueforti. Характерные «ноздри» в швейцарском сыре образуются за счет выделения двуокиси углерода — продукта пропионовокислого брожения молочной кислоты под действием бактерий рода Propionibacterium.
Таблица???
Микробиология молочнокислых продуктов
| Продукт | Процесс | Основные микроорганизмы | |
| Сливочное масло | Молочнокислое брожение | Lactobacillus bulgaricus | |
| Йогурт | То же | L. bulgaricus+ Streptоcoccus thermophilus | |
| Кефир | Спиртовое и молочнокислое брожение | Streptococcus lactis + L. bulgaricus + Cбpaживающие лактозу дрожжи | |
| Сыры (в целом)
| Первичное молочнокислое брожение |
| |
| при температуре 35 °С | S. lactis или S. cremoris | ||
| при температуре 42 °С | Различные термофильные молочнокислые бактерии, в основном Lactobacillus | ||
| Твердые сыры (например, чеддер или швейцарский) | Протеолиз и липолиз | Различные молочнокислые бактерии в сыре | |
| Мягкие сыры (например, камамбер, бри и лимбургский) | То же | Вначале на поверхности сыра растут грибы (Geotrichum candidum и Penicillium spp.), затем иногда развиваются Bacterium linens и В. erythrogenes | |
| Швейцарский сыр | Пропионовокислое брожение | Propionibacterium spp. | |
| Рокфор | Липолиз и образование синего пигмента | Penicillium roqueforti |
Получение сливочного масла также является отчасти микробиологическим процессом, поскольку для отделения жира в процессе сбивания необходимо предварительное скисание сливок, которое вызывают стрептококки молока. Эти микроорганизмы образуют небольшое количество ацетоина, спонтанно окисляемого до диацетила, обусловливающего вкус и запах масла. Стрептококки сильно различаются по способности образовывать ацетоин, поэтому обычно пастеризованные сливки заражают чистыми культурами отобранных штаммов.
Во многих странах молоко подвергают спонтанному сбраживанию смешанного типа под действием молочнокислых бактерий и дрожжей; при этом получаются кислые, иногда содержащие небольшое количество алкоголя напитки (например, кумыс).
Роль микроорганизмов в производстве молочных продуктов суммирована в табл.???.
МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
На растительных продуктах обычно присутствуют определенные молочнокислые бактерии. Эти микроорганизмы ответственны за процессы, происходящие при приготовлении соленых огурцов, кислой капусты и маслин. При молочнокислом брожении такого рода субстратом брожения служат присутствующие в растительных продуктах сахара. Образующаяся молочная кислота придает продукту специфический вкус и предотвращает дальнейшее развитие в нем микроорганизмов.
Молочнокислое брожение как средство сохранения продуктов от порчи используется также при силосовании корма для скота. После того, как растительный материал претерпел брожение, его можно хранить в течение длительного времени, не опасаясь разложения.
Необходимо отметить, что естественной средой обитания молочнокислых бактерий в природе можно считать поверхность растений. Хотя некоторые исследователи иногда говорят и о почве
Некоторые молочнокислые бактерии, относящиеся к роду Leuconostos, при выращивании на сахарозе выделяют в среду большое количество полисахарида, который называется декстраном. Декстран — полиглюкоза с высоким, хотя и варьирующим для разных штаммов молекулярным весом (от 15000 до 20000000). Эти молочнокислые бактерии привлекли к себе внимание микробиологов из-за тех неприятностей, которые причинили пищевой промышленности: они размножались в установках по очистке сахара, и огромное количество образующегося клейкого полисахарида очень мешало производству.
В настоящее время декстран производят промышленным способом. Это производство стимулировалось тем, что, как оказалось, поперечносшитые нерастворимые в воде производные декстрана можно использовать в качестве молекулярных сит. Колонки с такими модифицированными декстранами (коммерческое название сефадекс) задерживают небольшие молекулы, что позволяет разделять растворенные вещества, различающиеся по молекулярному весу. Колонки, с сефадексом после соответствующей калибровки можно использовать для определения молекулярных весов в диапазоне от 700 до 800 000.
Другой класс полисахаридов, получаемых микробиологической промышленностью, — это сложные в химическом отношении внеклеточные полисахариды, синтезируемые аэробными псевдомонадами группы Xanthomonas. Благодаря своим физическим свойствам эти вещества способны образовывать тиксотропные гели, устойчивые к нагреванию. Эти свойства позволяют широко использовать данные полисахариды в промышленности, в первую очередь в качестве смазочных материалов при бурении нефтяных скважин и в качестве загустителя для водорастворимых красок.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАСЛЯНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Для высвобождения определенных компонентов растительных тканей издавна используется вымачивание — регулируемое разложение растительных материалов под действием микроорганизмов. Древнейший из таких процессов, который использовался человеком на протяжении нескольких тысячелетий, — вымачивание льна и пеньки для получения волокон, применяемых затем для изготовления холста. В стебле растения эти волокна, состоящие из целлюлозы, соединены друг с другом связывающим веществом – пектином; разделить их физическими методами очень трудно. Стебли растений замачивают в воде и в них по мере набухания развиваются аэробные микроорганизмы, которые используют весь растворенный кислород и создают подходящие условия для последующего развития анаэробных маслянокислых бактерий. Эти микроорганизмы эффективно разрушают пектин и разъединяют волокна. Если вымачивание затягивается, в среде могут развиться бактерии, сбраживающие целлюлозу, которые разрушают и волокна.
Процесс, аналогичный вымачиванию, применяется для получения картофельного крахмала. Его цель — освободить клетки картофельного клубня, содержащие крахмал, от пектина, который их окружает.
Маслянокислое брожение осуществляют бактерии из рода Clostridium. Некоторые виды Clostridium широко использовались для производства промышленных растворителей ацетона и бутанола. Некоторые из них превращают далее масляную кислоту в бутанол, а уксусную кислоту — в этанол и ацетон. Многие клостридии сбраживают сахара с образованием двуокиси углерода, водорода и масляной кислоты. Промышленное освоение так называемого ацетонобутилового брожения, которое осуществляется Clostridium acetobutylicum, началось в Англии накануне первой мировой войны. Во время войны это производство стало быстро развиваться, поскольку ацетон использовался как растворитель при производстве взрывчатых веществ. С окончанием войны спрос на ацетон упал, но само производство не утратило своего значения, поскольку второй основной продукт брожения, бутанол, стал применяться как растворитель, обеспечивающий быстрое высыхание нитроцеллюлозных красок, которые применяются в автомобильной промышленности. Рентабельность производства была связана еще и с тем, что в качестве побочного продукта брожения можно было получать витамин рибофлавин.
В настоящее время эта отрасль микробиологической промышленности почти полностью исчезла в результате развития более эффективных методов синтеза данных продуктов. Ацетон и бутанол получают в больших количествах из нефти, а рибофлавин — в основном микробиологическими методами, основанными на использовании дрожжей.
Ацетонобутиловое брожение внесло важный вклад в развитие технологии промышленной микробиологии. Это был первый крупномасштабный процесс, для успешного протекания которого решающее значение имело исключение посторонних микроорганизмов. Среда, используемая для выращивания Clostridium acetobutylicum, благоприятна и для развития молочнокислых бактерий, которые быстро подавляют дальнейший рост клостридиев. Еще более серьезная проблема — заражение среды бактериальными вирусами, к которым клостридии весьма чувствительны. Таким образом, ацетонобутиловое брожение может осуществляться только при тщательном микробиологическом контроле. Создание этой отрасли промышленности привело к первому успешному крупномасштабному внедрению метода чистых культур, который позднее был усовершенствован в связи с промышленным производством антибиотиков.
Окисление этанола до уксусной кислоты — пример неполного окисления, которое осуществляется уксуснокислыми бактериями. Промышленное значение имеют и некоторые другие неполные окислительные превращения под действием этих бактерий.
Дрожжи издавна широко используются человеком. В природе существует множество родов и видов этих микроорганизмов, и многие из них применяются в промышленности, но особенно большое значение имеют различные штаммы Saccharomyces cerevisiae. С их помощью получают вино, пиво, заквашивают тесто.
Производство алкогольных напитков было широко развито уже на самых ранних этапах человеческой цивилизации; существует множество мифов о происхождении вина, которые приписывали его открытие божественному откровению. Следовательно, уже в глубокой древности возникновение винодельческого искусства было окутано тайной доисторических времен. Дрожжи для заквашивания теста впервые были использованы в Египте около 6000 лет назад, и с того времени этот способ получения дрожжевого теста медленно распространился по западному миру.
Способ перегонки спирта и, следовательно, его концентрирования был открыт в Китае или арабских странах. В Европе винокуренные заводы появились в середине VII в. Вначале получаемый спирт использовался человеком только для приготовления напитков, но затем в связи с промышленной революцией он стал применяться как растворитель и химическое сырье.
ПРОИЗВОДСТВО ВИНА
В основе получения вина лежит сбраживание растворимых сахаров (глюкозы и фруктозы) виноградного сока с образованием этилового спирта и СО2 После сбора виноград давят и получают сырой сок, или виноградное сусло (муст), очень кислую жидкость, содержащую от 10 до 25% сахара (по весу). Зачастую закваской служит смешанная дрожжевая флора винограда. При таком естественном брожении в популяции дрожжей происходят сложные последовательные изменения; на последней стадии преобладают так называемые истинные винные дрожжи, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus. В Калифорнии, например, муст сначала обрабатывают двуокисью серы, которая практически полностью уничтожает естественную дрожжевую флору, а сусло затем заквашивают нужным штаммом винных дрожжей. Брожение идет бурно и обычно заканчивается через несколько дней. Часто приходится регулировать скорость брожения или охлаждать смесь, чтобы предупредить повышение температуры, которое может повлиять на качество продукта или убить дрожжи. Муст, приготовленный как из черного, так и из белого винограда (Vitis vinifera), не окрашен, из него получается белое вино. Краситель черного винограда содержится в. кожуре, поэтому красное вино получают при брожении муста в присутствии кожуры. Спирт, образующийся при брожении, экстрагирует краситель, и вино окрашивается. По окончании брожения молодое вино необходимо осветлить, стабилизировать и дать ему созреть. Эти процессы занимают несколько месяцев, а при изготовлении высококачественных. красных вин — даже несколько лет. В течение первого года во многих винах (в частности, красных) происходит второе - спонтанное яблочно-молочнокислое брожение, которое вызывается рядом молочнокислых бактерий (Pediococcus, Leuconostoc или Lactobacillus). В результате яблочная кислота, одна из двух основных органических кислот винограда, превращается в молочную кислоту и С02; таким образом, дикарбоновая кислота превращается в монокарбоновую, и кислотность вина снижается. Хотя яблочно-молочнокислое брожение происходит спонтанно, медленно и постепенно (часто даже без ведома винодела), оно абсолютно необходимо для
производства высококачественных красных вин из винограда, выращенного в местностях с холодным климатом, так как полученные из него вина первоначально обладают слишком высокой кислотностью и потому плохими вкусовыми качествами.
Некоторые особые виды вин подвергают дополнительным превращениям под действием микробов. Игристые вина (типа шампанских) подвергают второму спиртовому брожению под давлением, добавляя в вино сахар. Образующаяся двуокись углерода газирует вино. Второе брожение осуществляется различными винными дрожжами, которые после брожения образуют комки и легко удаляются. Херес (тип вина, которое производится в Испании в районе Херес) крепят добавлением спирта до 15% и выдерживают на воздухе, в результате чего на поверхности интенсивно развиваются определенные дрожжи; это придает вину неповторимый хересный вкус.
Некоторые европейские десертные вина, в частности вина из южных районов Франции, претерпевают еще более сложные превращения под действием микробов. Перед сбором виноград спонтанно заражается грибом Botrytis cinerea. Это вызывает потерю воды, а потому увеличение содержания сахара и разрушение яблочной кислоты, что снижает кислотность винограда, улучшает его вкус и цвет. Очень сладкий муст, который получается из этого зараженного грибом винограда, сбраживается так называемыми глюкофильным дрожжами, т. е. дрожжами, которые быстро сбраживают глюкозу, оставляя нетронутой фруктозу (более сладкую из этих двух сахаров). В результате получается сладкое десертное вино.
Хотя из-за высокого содержания спирта и низкого значения рН (~ 3, 0) вина являются плохим субстратом для роста большинства микроорганизмов, они тем не менее могут noртиться под действием микробов. Первым проблему «болезней» вин с научной точки зрения исследовал Пастер. Сделанные им описания микроорганизмов, вызывающих порчу, рекомендации по предупреждению их развития не утратили своего значения до сих пор. Быстрее всего вина портятся при воздействии воздуха. Дрожжи и уксуснокислые бактерии, образующие пленку, при своем росте используют спирт и пpeвращают его в уксусную кислоту; таким образом вино скисает. Вино портится и возбудителями брожения в отсутствие воздуха, в частности палочковидными молочнокислыми бактериями, которые способны расти в анаэробных условиях, используя остаточный сахар и придавая вину «мышиный» привкус. Винные дрожжи могут расти в сладких винах даже после разлива вина в бутылки. Хотя их рост и не влияет на букет, вино становится мутным и теряет привлекательность. Порчу вина можно предупредить пастеризацией, но иногда она снижает его качество.
Особенно подвержены порче вина с низким содержанием спирта, содержащие сахар. В них обычно добавляют специальные химические вещества (например, двуокись серы) или стерилизуют путем фильтрации. Роль различных микроорганизмов в производстве и порче вин описана в табл.????.
ИЗГОТОВЛЕНИЕ ПИВА
Пиво производят из зерна, которое в отличие от винограда и других фруктовых мустов, не содержит сбраживаемых сахаров. Крахмал зерна перед сбраживанием дрожжами необходимо осахарить (гидролизовать до сбраживаемых сахаров мальтозы и глюкозы). Для производства пива издавна использовались три основных вида зерновых: ячмень в Европе, рис на Востоке и кукуруза в Америке. В каждом случае для осахаривания крахмала использовался свой метод. При изготовлении пива из ячменя применяют ферменты, гидролизующие крахмал самого зерна (амилазы). Семена ячменя практически не содержат амилазу, но при прорастании образуются большие количества этого фермента. Ячмень увлажняют, дают ему прорасти, а затем сушат и хранят для последующего использования. Такой высушенный проросший ячмень называется солодом. В результате высушивания при повышенных температурах он приобретает темную окраску и становится более ароматным, чем необработанные зерна ячменя. При соложении крахмал ячменя остается почти нетронутым, поэтому первый этап в изготовлении пива состоит в размалывании солода и его суспендировании в воде, чтобы произошел гидролиз крахмала. Иногда солод используется в качестве единственного источника крахмала; если же хотят получить светлое пиво, к смеси для осахаривания добавляют ячмень, не подвергавшийся соложению, или другое зерно. В США при производстве пива используется в большом количестве рис. Одновременно с гидролизом крахмала происходят другие ферментативные процессы, в том числе гидролиз белков. После того как осахаривание смеси достигает требуемого уровня, ее кипятят, чтобы остановить дальнейшие ферментативные превращения, и затем фильтруют. К фильтрату (затору) добавляют хмель (прицветники женских соцветий вьющегося растения Humulus lupus), который содержит растворимые смолистые вещества, придающие пиву характерный горький вкус и предотвращающие рост бактерий в нем. Хмель при изготовлении пива стали использовать сравнительно недавно, в середине XVI в.; в некоторых странах до сих пор делают пиво без хмеля. После фильтрации затор, содержащий хмель (пивное сусло), готов к сбраживанию.
В отличие от сбраживания вина при сбраживании пива в него вносят большое количество дрожжей определенного штамма, полученных в результате предыдущего сбраживания. Брожение идет при пониженной температуре в течение 5—10 дней. Все дрожжи, используемые при изготовлении пива, относятся к виду Saccharomyces cerevisiae, но не все штаммы S. cerevisiae позволяют получить хорошее пиво. Со временем были отобраны особые штаммы, обладающие нужными свойствами; они называются пивными (культурными) дрожжами. До Пастера отбор и поддержание нужных штаммов дрожжей проводили эмпирически и это было своего рода искусством. Успех зависел главным образом от способности пивовара получить подходящий штамм и поддерживать его от партии к партии пива, не допуская сильного загрязнения нежелательными микроорганизмами. Хорошие пивные дрожжи выводили веками; в природе их найти невозможно. Подобно культурным высшим растениям, такие дрожжи — продукт человеческой деятельности, и, чтобы отметить этот факт, пивовары называют другие дрожжи (в том числе другие штаммы S. cerevisiae) «дикими».
Штаммы пивных дрожжей делятся на две основные группы; их называют верхними и нижними дрожжами. Верхние дрожжи эффективно сбраживают пиво; лучше всего они «работают» при сравнительно высокой температуре, (20 °С) и используются при изготовлении крепких сортов пива с высоким содержанием алкоголя, например английского эля. Свое название эти дрожжи получили благодаря тому что во время брожения они увлекаются в верхнюю часть бродильного чана из-за интенсивного выделения СО2. Нижние дрожжи, наоборот, сбраживают пиво медленно, "работают" лучше при более низкой температуре (от 12 до 15 °С) и используются при изготовлении более легких сортов пива с низким содержанием алкоголя. В США обычно производится пиво именно этого типа. Названы нижние дрожжи так потому, что образование СО2 идет медленнее и во время брожения они оседают на дно.
Болезни пива, как и болезни вина, были впервые исследованы с научной точки зрения Пастером. Чаще всего они возникают во время брожения, созревания и после разлива бутылки. Один из возбудителей — «дикие» дрожжи Saccharomyces pasteurianus, которые придают пиву неприятную горечь. Они развиваются главным образом в том случае, если температура при созревании или хранении пива слишком высока. Скисание пива могут порой вызывать и уксуснокислые бактерии, особенно если пиво, разлитое в бочки, подвергается действию воздуха. Чтобы избежать порчи, нужно, прежде всего, использовать чистые штаммы дрожжей в начале брожения и пастеризовать конечный продукт. В настоящее время некоторые сорта пива перед разливом в бутылки стерилизуют с помощью фильтрации, что позволяет сохранить вкус пива, ухудшающийся при пастеризации.
На Западе наиболее распространенные напитки, при изготовлении которых используется брожение, — это виноградные вина и ячменное пиво. На Востоке же сырьем для большинства таких напитков (например, сакэ) является рис. Для гидролиза рисового крахмала перед сбраживанием используются амилазы плесневых грибов, в основном Aspergillus оrуzае. Первая стадия изготовления сакэ — получение культуры плесени. Споры плесени, взятые от предыдущей партии, рассевают на замоченный рис и выращивают гриб до тех пор, пока мицелий не проникнет во всю массу риса. Этот материал (так называемый койи) служит как источником амилазы, так и посевным материалом для добавления в большую партию замоченного риса. Происходит гидролиз крахмала, и когда накапливается достаточное количество сахара, начинается спонтанное спиртовое брожение. В койи присутствую как молочнокислые бактерии, так и дрожжи, поэтому кроме спирта и СО2 образуется молочная кислота. Таким образом, производство спиртных напитков из зерна на Востоке отличается от процессов, применяемых на Западе, в двух отношениях: осахаривание осуществляется микроорганизмами и происходит одновременно с брожением.
В Америке и в некоторых районах Среднего Востока используется еще один, третий компонент, вызывающий осахаривание, — человеческая слюна, содержащая амилазы. Индейцы Центральной и Южной Америки готовят кукурузное пиво, пережевывая зерна и выплевывая смесь в сосуд, где она претерпевает спонтанное спиртовое брожение.
Таблица????
Перечень некоторых микроорганизмов, использующихся при изготовлении вина и вызывающих его порчу.
| Микроорганизм | Роль микроорганизма в процессе изготовления вина или его порче | Вызываемые химические или физические изменения | |
| Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus | 1. Осуществляют первичное спиртовое брожение 2. Вызывают насыщение углекислым газом игристых вин за счет вторичного брожения 3. Вызывают помутнение десертных вин | Глюкоза и/или фруктоза à Этанол + CO2 | |
| Pediococcus, Leuconostoc и Lactobacillus | Осуществляют яблочно-молочнокислое брожение | 1. Яблочная кислота à Молочная кислота + СО2 2. Обогащение букета | |
| . Хересные дрожжи (Saccharomyces beticus, cheresiensis и fermenti) | В процессе роста образуют на поверхности вина пленку и придают ему хересный вкус | 1. Окисление этанола до ацетальдегида 2. Образование компонентов букета | |
| Botrytis cinerea | В некоторых районах (например, в провинции Сотерн во Франции) развиваются на поверхности винограда, используемого для приготовления десертных вин | 1. Обезвоживание винограда 2. Окисление яблочной кислоты до СО2 и H2O 3. Формирование букета и цвета | |
| Уксуснокислые бактерии и дрожжи, образующие пленку | Вызывают порчу вина на воздухе | Окисление этанола до уксусной кислоты | |
| Молочнокислые бактерии, особенно Lactobacillus trichodes | Вызывают порчу вина в анаэробных условиях | Появление «мышиного» привкуса | |
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Если вино и пиво подвергаются воздействию воздуха, они часто портятся — скисают. Скисание обусловлено окислением спирта до уксусной кислоты, которое осуществляют строго аэробные уксуснокислые бактерии. Спонтанное скисание вина лежит в основе традиционного метода получения уксуса. (На французском языке слово «уксус», vinaigre, означает буквально «кислое вино».)
Производство уксуса все еще остается в основном эмпирическим процессом. Усовершенствования, введенные на протяжении XIX столетия, касались главным образом механических, а не микробиологических аспектов производства. В традиционном орлеанском методе, который до сих пор используют во Франции, деревянные чаны наполняют вином, на поверхности которого развиваются уксуснокислые бактерии, образующие студенистую пленку. Превращение этанола в уксусную кислоту занимает несколько недель. Скорость процесса лимитируется диффузией воздуха в жидкость. Получается продукт очень высокого качества, чем и объясняется то, что этот неэффективный метод применяется до сих пор.
Самый старый из этих методов был разработан в XIX в. Бродильный чан заполняют деревянными стружками, не утрамбовывая их, и впрыскивают тонкими струйками спиртовой раствор, а навстречу ему вдувают воздух. Уксуснокислые бактерии развиваются на стружках в виде тонкой пленки; тем самым максимально увеличивается площадь, и аэрируемая, и богатая питательной средой. После развития на поверхности стружек популяции бактерий следующие партии уксуса производятся довольно быстро; раствор, содержащий вначале 10% спирта, можно превратить в уксусную кислоту за 4—5 дней. Этот метод до сих пор применяется довольно широко, но в настоящее время все чаще используются глубокие бродильные чаны с интенсивным перемешиванием, подобные тем, которые применяются при получении антибиотиков.
Так, используя, уксуснокислые бактерии, из глюкозы получают глюконовую кислоту, которая применяется в фармацевтической промышленности. Уксуснокислые бактерии превращают ряд многоатомных спиртов в сахара. Одна из таких реакций используется в промышленности для получения сорбозы из сорбитола. Сорбоза служит суспендирующим агентом при приготовлении многих лекарственных препаратов и является промежуточным продуктом синтеза L-аскорбиновой кислоты (витамина С).
ХЛЕБОПЕЧЕНИЕ
Спиртовое брожение под действием дрожжей — основной этап при изготовлении хлеба. Этот процесс называется заквашиванием теста. В муку, смешанную с водой, добавляют дрожжи и оставляют смесь в теплом месте на несколько часов. Сама мука почти не содержит свободного сахара, который мог бы служить субстратом при брожении, но в ней присутствует ряд ферментов, расщепляющих крахмал и образующих достаточное количество сахара, чтобы поддерживать брожение. В обычно используемых высокоочищенных сортах муки эти ферменты разрушены, и сахар приходится добавлять в тесто. Он быстро сбраживается дрожжами, а образующаяся двуокись углерода задерживается в тесте и заставляет его подниматься. Образующийся спирт удаляется в процессе выпечки. Дрожжи вызывают и другие, менее заметные изменения физических и химических свойств теста, влияющих на структуру и вкусовые качества хлеба. Это стало ясно, когда в хлебопечении попытались применить изобретенный немецким химиком Либихом (J. von Liebeg) особый порошок — смесь веществ, которые при смачивании выделяют двуокись углерода. Либих предполагал, что этот порошок заменит дрожжи, но этого не произошло, хотя он широко применяется при изготовлении кондитерских изделий.
Все дрожжи, которые используются в хлебопечении, относятся к виду Saccharomyces cerevisiae и исторически происходят от штаммов верхних дрожжей, используемых в пивоварении. До XIX в. дрожжи для хлебопечения получали прямо из ближайшей пивоварни. В связи с выпечкой хлеба в промышленных масштабах развилась целая отрасль по производству прессованных дрожжей. Крупный современный хлебозавод потребляет ежедневно десятки килограммов дрожжей, поскольку на каждые 12 кг муки потребляется примерно 2 кг дрожжей. Как правило, пекарские дрожжи в настоящее время специальным образом высушивают, чтобы сохранить жизнеспособность дрожжевых клеток. Такая обработка облегчает перевозку и хранение дрожжей.
МИКРОБЫ КАК ИСТОЧНИК БЕЛКА
Благодаря своему быстрому росту, высокому содержанию белка и способности использовать дешевые органические субстраты микроорганизмы являются ценным потенциальным источником питания животных. Потребности животноводства привели к развитию новой отрасли промышленности — производству дрожжей, которые добавляют в корм животным. Поскольку задача этого производства состоит в получении клеточной массы, микроорганизмы выращивают при интенсивной аэрации, чтобы получить максимальный урожай. Но даже в этом случае при использовании углеводов в качестве субстратов они частично сбраживаются в спирт, поэтому вместо дрожжей, вызывающих брожение, используют строго аэробные дрожжи рода Candida.
Стоимость сырья — фактор первостепенной важности при производстве микроорганизмов в качестве корма, и для выращивания кормовых дрожжей вначале использовали дешевые источники углеводов (например, сыворотку, мелассу, другие отходы производства). Однако в аэробных условиях субстратом могут служить любые соединения, поддерживающие дыхательный метаболизм, в частности углеводороды нефти. Нефть пока гораздо дешевле, чем другие возможные субстраты, а поскольку углеводороды — самые восстановленные из органических соединений, рост на них идет весьма эффективно.
В настоящее время интенсивно разрабатываются и другие методы получения бактериального белка на основе использования дешевых субстратов. Один из таких потенциальных субстратов — газ метан, главный продукт нефтехимического производства. Однако, чтобы наладить эффективный самоокупаемый процесс, необходимо разрешить еще много проблем. Важнейшие из них—относительно медленный рост бактерий, окисляющих метан, и их склонность к выделению большого количества слизи.
Ценность микроорганизмов при использовании их в качестве корма или добавки к корму для скота состоит в высоком содержании в биомассе белка. В связи с этим микроорганизмы являются наилучшим орудием для быстрого и эффективного превращения доступных органических соединений в нужный белок. Это становится особенно очевидно, если сравнить эффективность образования белка сельскохозяйственными животными и дрожжами. Так, в организме быка весом 500 кг за 24 ч образуется примерно 0, 4 кг белка. 500 кг дрожжей синтезируют за то же время в благоприятных условиях более 5000 кг белка.
Многие растительные корма содержат достаточно белка, чтобы удовлетворить пищевые потребности млекопитающих в количественном отношении, но они не могут служить единственным источником белка, так как обеднены некоторыми необходимыми аминокислотами. Белки пшеницы бедны лизином, белки риса — лизином и треонином, кукурузы — триптофаном и лизином, белки бобов и гороха — метионином. Добавление недостающей аминокислоты (или аминокислот) в рацион, содержащий единственный источник растительного белка, делает этот рацион полноценным. Целесообразность добавления отдельных аминокислот в пищу была четко обоснована в многочисленных экспериментах, как на животных, так и на человеке. Нехватка определенных аминокислот, в первую очередь лизина, треонина и метионина, является более важной проблемой, чем нехватка белка. Поэтому возможность использования микроорганизмов для получения определенных аминокислот
