Тема 2 Культивируемые клетки растений как объект биотехнологии

План лекции:

1. История развития метода культуры клеток и тканей растений.

2. Теоретические и методические принципы культивирования клеток растений.

3. Получение и культивирование каллуса.

4. Биология культивируемых клеток.

 

Самые ранние работы по изолированию культур принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ, Саксу (1893). В этих исследованиях зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях. Первым исследователем, занявшимся установлением минимального размера экспланта, был Карл Рехингер (1893). Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм. Еще в 19 веке Х. Фёхтинг провел ряд экспериментов, доказывающих тотипотентность клетки. При этом им убедительно показана полярность как органов, так и клеток.

Основы экспериментальной эмбриологии растений были заложены исследованиями Моссарта (1902), который наблюдал набухание завязей некоторых растений после обработки их спорами Licopodium, нежизнеспособными поллиниями и водными экстрактами пыльцы. В связи с этим было высказано предположение, что пыльцевая трубка не только обеспечивает передвижение спермиев к яйцеклетке, но и переносит в завязь ауксины, стимулирующие ее рост.

Г.Габерланд (1902) научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени. Но он выбрал для культивирования зеленые клетки, изолированные из клеток палисадной паренхимы Lamium purpureum и волосков традесканции вирджинской и медуницы мягкой, резонно рассудив, что при этом отпадет потребность в источниках углеводов. Однако упустил из виду то, что ассимилирующие зеленые клетки - зрелые и высокодифференцированные, потеряли способность к меристематической деятельности. Исходное предположение автора, что содержащие хлорофилл клетки полностью обеспечивают себя питательными веществами, необходимыми для их жизнедеятельности и роста, не было подтверждено экспериментально. Габерланд также выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, которая впоследствии была подтверждена экспериментально.

Практически одновременно и независимо от Коттэ Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах.

Начало длительным и удачным исследованиям по культивированию клеток и тканей растений положили работы американского исследователя Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Такую же способность наблюдал Ф. Уайт для клеток опухолевого происхождения. Результаты чужих и собственных экспериментов Уайт обобщил в монографии «Культура растительных тканей», которая была переведена на русский язык.

В 1960 - 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов. Осново­положник этого метода - Э. Коккинг. Такебе с сотрудниками были определены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют клеточные стенки, делятся и дают начало клеточным линиям, способным к морфогенезу. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. В лабораториях Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глебы проводились исследования по­ведения ядерного и цитоплазматического геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и потомстве соматических гибридов растений - регенерантов. В этот же период были разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей. Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2^оС, +10^оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) Выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) Непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Каллус – это образовательная ткань, расположенная в местах ранения растения. Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (in vitro).

В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг / л, в зависимости от вида экспланта.

Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Различное тканевое происхождение каллусных клеток является одной из причин гетерогенности каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации. В качестве примера можно привести процессы, происходящие при дедифференцировке апикальной меристемы стебля. После помещения на питательную среду меристемы стебля томатов отмечено прекращение митоза, клетки увеличиваются в размерах, теряют характерную для меристематической ткани форму, изменяется структура ядра и цитоплазмы. В готовящейся к делению клетке возрастает синтез всех форм РНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клетки при дедифференцировке.

Поверхностное культивирование осуществляют на полужидкой агаризованной среде, среде с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Можно также использовать комочки ваты, пропитанные питательной средой, которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бумаги.

В жидкой среде получают клеточную суспензию, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой питательной среды.

Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50—60%, многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя.

Все эти обстоятельства определяют продолжительный рост популяции клеток при накопительном, или периодическом, выращивании. Поддержание стерильности длительное время также является одной из технических проблем, особенно при непрерывном культивировании.

Периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее время в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них — женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.

Получение вторичных метаболитов имеет свои особенности. Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе. Некоторые алкалоиды активно синтезируются в фазе максимальной митотической активности (экспоненциальный рост), что является исключением. Знание таких закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ. Механизмы и условия, блокирующие активный рост клеток и клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и увеличивать их выход. Необходимо учитывать, что вопрос взаимодействия первичного и вторичного метаболизма, рассмотренный нами в упрощенном виде, намного сложнее.

Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.

Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.

При медленном протоке среды, т. е. при медленном росте культура испытывает сильную лимитацию, глубокое голодание по данному субстрату. При быстром протоке среды, т. е. при быстром росте степень голодания слабая, приближающаяся к условиям экспоненциального роста.

Хемостатный способ культивирования в строго контролируемых условиях является основным для изучения физиологии, биохимии и вообще всех свойств микробных клеток и культур.

Хемостат имеет аналоги в природе. Аналогия заключается в том, что подобные устройства – это открытые непрерывные системы, через которые постоянно идут потоки энергии и веществ. Поэтому непрерывное культивирование может моделировать в лаборатории природные условия (например, в водоеме, в пищеварительном тракте) и служить для изучения вопросов экологии.  При этом за короткое время можно наблюдать явления, происходящие в природе длительное время и выявить экологические закономерности. Другой широко известный принцип управления процессом – турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры.

Скорость разбавления сама устанавливается в соответствии с заданной плотностью популяции. Этим турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется скорость разбавления, соответственно которой устанавливается концентрация биомассы. Хотя теоретически взаимосвязь между концентрацией биомассы и скоростью разбавления подчиняется одним и тем же закономерностям в хемостате и турбидостате, методы управления процессами различны. Турбидостат позволяет получать скорости роста; равные максимальной скорости, которые применяются при изучении культур, фиксированных в стадии экспоненциального роста. Хемостаты же применяют при скоростях, разбавления от самой низкой до только приближающейся к максимальной удельной скорости роста. Поскольку в турбидостате скорость роста не фиксирована, при избытке субстрата и постоянных условиях среды в культуре могут отбираться быстро растущие мутанты. Турбидостат также может использоваться для того, чтобы получать мутанты, более устойчивые к ингибирующим рост факторам.

Выделяют два типа культивируемых растительных клеток: нормальные и опухолевые.

Опухолевые клетки морфологически мало отличаются от каллусных. Физиологическим различием является гормононезависимость опухолевых клеток. Благодаря этому свойству опухолевые клетки делятся и растут на питательных средах без добавок фитогормонов. Эти клетки также лишены способности дать начало нормально организованным структурам (корни, побеги) в процессе органогенеза. Иногда они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), дальнейшее развитие которых невозможно.

Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществляют на полужидкой агаризованной среде, среде с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Можно также использовать комочки ваты, пропитанные питательной средой, которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бумаги.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;

- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.

В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 - 30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани.

Неорганизованно растущая каллусная ткань характеризуется тремя типами клеток: мелкими, средними и крупными. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу.

Клетки меристемы с самых ранних стадий развития отличаются от каллусных высоким содержанием РНК и белка. При образовании соматических эмбриоидов каллусная клетка средних размеров обособляется, ограничивается плотной оболочкой, теряет крупные вакуоли. Она содержит крупное структурированное ядро с ядрышком. Клетка делится митотически, в результате чего возникают 2 клетки проэмбрио. Последующие деления клеток приводят к формированию шаровидного зародыша, а также органа, аналогичного суспензорам в зародышевом мешке семяпочки. Дальнейшее развитие соматического эмбриона через ряд стадий ведет к регенерации целого растения с корнями и побегами, так как в этом случае формируется биполярная структура.

Каллусы с высоким морфогенетическим потенциалом обычно матовые, компактные, структурированные, имеют зеленые хлорофиллсодержащие участки, которые представляют собой зоны морфогенеза. Впоследствии там формируются побеги или растения-регенеранты. В культуре также встречаются каллусы рыхлые, не имеющие глобулярного характера. Такие каллусы либо совсем не способны к органогенезу, либо формируют только корни. Появление корней свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в сторону ауксинов, что препятствует образованию побегов. Эти каллусы могут остаться ризогенными, и регенерировать из них растения не удастся. Неморфогенные каллусы могут быть переведены в суспензионную культуру для получения вторичных метаболитов.

Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами — утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается «включением» разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных генов входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий.

Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных органов. Как это осуществляется — один из труднейших вопросов клеточной биологии. Между геномами в клетках, которые приобретают разную форму и функцию, по-видимому, нет качественных различий, и клетки эти начинают различаться только вследствие разной экспрессии генов. Вновь возникшая клетка обладает широкими потенциями и может развиваться по любому из многих путей в морфологическом и физиологическом смысле.

Детерминация (определение) пути развития каждой клетки является основой физиологии развития. Вступление на тот или иной путь развития определяется особым набором белков, т. е. каждая специализированная клетка вырабатывает только ей свойственные белки, что является следствием дифференциальной активности генов — экспрессии одной группы генов при одновременной репрессии других. Способность одной-единственной зрелой соматической клетки дать начало целому организму (тотипотентность) показывает, что в процессе нормальной клеточной дифференциации у растений не происходит утраты или необратимой инактивации каких-либо генов.

У растений почти всякая дифференциация обратима при условии, если дифференцированная клетка живая, в протопласте сохранилось ядро и не образовалась вторичная оболочка.

Даже такие высокоспециализированные клетки, как микроспоры, с помощью ряда экспериментальных процедур можно заставить пролиферировать и дать начало целому растению. Итак, в определенных условиях многие из зрелых растительных клеток сохраняют способность делиться, а в некоторых случаях даже вступить на новый путь развития. Однако вопрос о том, как это происходит, какие события на молекулярном уровне сопровождают этот процесс, остается открытым.

Таким образом, после деления перед каждой дочерней клеткой открывается одна из трех возможностей. Клетка может оставаться эмбриональной и вновь вступить в клеточный цикл с последующим митозом либо может оказаться как бы «вне цикла» (G_o), перестав делиться, и наконец, приобретя компетенцию, постепенно детерминироваться и вступить на путь дифференцировки (специализации). Компетенция — способность клетки воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением развития.