По сэнгеру

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ

В основе этого метода секвенирования (также называемого секвенированием путем терминации цепи), лежит ферментативное построение комплементарной цепи ДНК на одноцепочечной матрице. При этом в разных местах цепи ДНК происходит ингибировании ее дальнейшего роста.

Компонентами реакции являются: одноцепочечная матрица ДНК; короткая затравочная молекула, комплементарная определенному участку матрицы; ДНК-полимераза (Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I E. coli); 2´-дезоксинуклеотид 5´-трифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ или просто дНТФ); 2´,3´-дидезоксинуклеотид 5´-трифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ или просто ддНТФ); реакционный буфер с ионами Mg²⁺.

Главным этапом этого процесса является терминация построения комплементарной цепи ДНК. Она происходит при включении ДНК-полимеразой модифицированных аналогов природных субстратов дидезоксинуклеотид трифосфатов, являющихся ингибиторами ДНК-полимеразы. Рост цепи прерывается из-за отсутствие второго гидроксильного остатка в З'-положении рибозного кольца у дидезоксипроизводных и невозможности присоединения к ним следующего нуклеотида. Поскольку в четырех реакционных пробирках (по типу оснований – А, С, G и Т) присутствует огромное количество молекул секвенируемой ДНК, во много раз превосходящее ту длину фрагмента, которую могла построить ДНК-полимераза, то по теории вероятности каждое положение этого типа оснований во фрагменте ДНК оказывается представленным соответствующим ддНМФ.

Еще одним важным моментом является разный размер полученных фрагментов ДНК. Разница в размерах определяется тем, что все З'-концы фрагментов вновь синтезируемой цепи ДНК во всех четырех реакционных пробирках были терминированы соответствующими ддНМФ и, таким образом, представляли собой полный набор всех возможных длин в пределах секвенируемого участка, построенного ДНК-полимеразой. Что касается 5'-конца всех этих фрагментов ДНК, принадлежащих новой цепи, то он должен быть для всех фрагментов строго одинаковым и принадлежать 5'-концу исходной затравочной молекулы.

Продукты реакций терминирования подвергаются денатурации и одноцепочечные меченые фрагменты разделяются по длине посредством электрофореза в полиакриламидном геле, позволяющим разделять фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид.

После электрофореза гель экспонировался на рентгеновскую пленку. С проявленной пленки “читали” последовательность нуклеотидов секвенируемого участка ДНК.

На рисунке схематично показан описанный выше процесс.