Отбор клеток с целевым геном и клонирование гена

Соединение гена с вектором (получение рекомбинантной ДНК

Существуют два варианта встраивания гена в вектор:

1) встраивание, когда оба компонента имеют липкие концы;

2) встраивание компоненты несут тупые (некомплементарные) концы.

По первому варианту, получившему название "шотган" (от англ 8Но^§ип — дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, образующей в месте разрыва одноцепочечные липкие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды. переведенные в линейную форму той же самой эндонуклеазой рест­рикции. В результате образуется сложная смесь гибридов фрагмент - ДНК-плазмида. Для поиска гибрида, несущего целевой ген, использу­ют процедуры скрининга. Как видим, этот метод объединяет два эта­па — выделение целевого гена и его встраивание в вектор.

По второму варианту ДНК необходимо снабдить липкими концами. С этой целью к З'-концам ее цепей присоединяют дезоксирибонуклеотис.-ные остатки одного типа, например, остатки аденозина. Синтез липког-: конца идет в присутствии АТР с помощью специфической трансферазы Эта трансфераза обладает групповой специфичностью к дезоксирибонук-леотидам, не нуждается в матрице; на обоих концах ДНК она катализи­рует синтез ро!у (А)-хвоста, состоящего из 50—100 остатков.

В свою очередь, плазмиду переводят в линейную форму, расщеп­ляя ее в одной точке рестрикционной эндонуклеазой с образовани­ем в месте расщепления тупых концов (некомплементарных хвос­там ДНК). К тупым концам линейной плазмиды присоединяют лип­кие ро!у (Т)-хвосты (комплементарные ро!у (А)-хвостам ДНК). После смешивания обоих компонентов встроенные липкие концы соединя­ются по комплементарным парам А-Т и их сшивают с помощью ДНК-лигазы, в результате чего образуется гибридная ДНК.

Введение гибридной ДНК в клетку-хозяина. Этот этап основан на том, что ДНК способна проникать в большинство эукариотических клеток. Однако эффективность этого проникновения весьма невелика (примерно 1—2 клетки из 10⁶). Ее увеличивают, подбирая специаль­ные условия. Так, например, существенно возрастает проникновение ДНК в клетки Е. соli, если в среду ввести ионы Са²⁺.

Завершаю­щий этап технологии рекомбинантной ДНК состоит в том, чтобы оп­ределить, какие клетки несут целевой ген; их выделить, создать опти­мальные условия для их размножения, т.е. осуществить клонирова­ние (воспроизводство) гена в необходимых масштабах.

Отбор можно осуществить по специфическим признакам либо век­тора, либо встроенного гена. Напомним: некоторые плазмидные век­торы сообщают клетке устойчивость к какому-либо антибиотику. Если в культуральную среду внести антибиотик, то можно осуществить раз­множение только тех клеток, которые устойчивы к антибиотику и подавить размножение и развитие клеток, в которые плазмида не про­никла. Другой подход, основанный на специфическом признаке гена, состоит в том, чтобы определить, какие клетки синтезируют белок, кодируемый целевым геном. Клетки можно отобрать из их колонии, развившейся на твердой питательной среде, однако, с той оговоркой, что эта колония явилась продуктом одной клетки.

Значение генной инженерии для науки и практики. В результа­те интенсивного развития методов генной инженерии получены кло­ны множества генов рибосомной, транспортной и 58 РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсули­на, интерферона человека и прочее. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.

Так, в настоящее время разработана и внедрена в промышленность технология синтеза таких гормонов, как инсулин, соматотропин, и некоторых противовирусных агентов (например, интерферона). Гены этих биологически активных соединений достаточно эффективно экспрессируются в клетке Е. соИ. В Японии и США на основе генно-инженерных методов производится эффективный противораковый пре­парат -- интерлейкин. К началу XXI в. около 200 новых диагности­ческих препаратов введено в медицинскую практику и более 100 ле­карственных средств находилось на стадии клинических испытаний.

К ним относятся лекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы. Ведутся исследования по предотвращению и подавлению СПИДа.

Большая роль отводится генной инженерии по выведению новых сортов культурных растений, способных к интенсивному синтезу: левого продукта, устойчивых к болезням и различным экстренным воздействиям. С этой целью разрабатываются системы перенос, растения специфических чужих генов и клонирование таких раст ний. Успешно осуществлен перенос генов с помощью плазмид виру А§гоЪа^егшт Ште/ас1епз. Растения, в хромосому которых вст{: ется целевой ген и способные к дальнейшему клонированию, назызг ются трансгенными. Впервые трансгенные растения были получена в 1982 г. в Институте растениеводства в Кельне и компании Мопзаг.:: Эти растения приобрели устойчивость к антибиотику канамицину. тормозящему рост. В настоящее время получены трансгенные расте­ния, способные противостоять воздействию различных вируснь: фекций. В генно-инженерных лабораториях Бельгии и США осуществлены работы по внедрению в растительные клетки генов, отвечаю­щих за синтез инсектицидов, защищающих растения от насекомых-вре­дителей. Получены и клонированы трансгенные растения картофеля и томатов, устойчивых к колорадскому жуку. С помощью методов генной инженерии делаются попытки создать растения, способные усваивать атмосферный азот; улучшать белковый состав растительной пищи, осуществлять синтез незаменимых аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков.

Методы клонирования успешно применяются при выращивании млекопитающих. В настоящее время с помощью различных способов клонируют овец, мышей, коров. Часто животные, полученные с при­менением генно-инженерных методов, имеют уникальные свойства и представляют значительный научный интерес. Так, например, могут быть клонированы животные, клетки которых моложе или старше их физиологического возраста.

Международная программа по расшифровке генома человека была начата в 1989 г., тогда же благодаря инициативе и энергии А. А. Баева к программе подключилась и Россия. Сейчас геномная программа уже доказала свое выдающееся значение для развития наших знаний о жизни в целом.

Считают, что программа по расшифровке генома человека в значи­тельной степени способствовала и развитию микробиологии. В настоящее время расшифрованы более 20 полных геномов, в том числе воз­будителей многих опасных болезней (туберкулеза, сыпного тифа, язвы желудка и др.). Знание геномной структуры патогенных бактерий очень важно для создания вакцин, для диагностики и других медицинских целей. Значительное влияние генная инженерия оказывает на меди­цинскую генетику, которая занимается генодиагностикой наследствен­ных болезней, генетическими основами предрасположенности ко мно­гим распространенным болезням.

Геномные методы идентификации личности имеют далеко идущие последствия для общества. Действительно, криминалистика получи­ла в свое распоряжение абсолютно надежный метод доказательства виновности или невиновности человека. Для анализа, называемого геномной дактилоскопией, достаточно одной капли крови, одного во­лоса, кусочка ногтя, следов пота, слюны и т.д.

6 апреля 2000 г. американская компания Се1ега Оепоппсз объявила о том, что закончила работу над декодированием трех миллиардов пар ге­нов, составляющих геном человека. Таким образом, Се1ега Оепогшсз опе­редила серьезный международный проект, финансируемый правитель­ствами нескольких стран. Однако необходимо определить функции каж­дого конкретного гена человека, что может оказаться более сложным, нежели просто нарисовать схему расположения генов.

Совершенно очевидно, что расшифровка генома человека сыграет важную, если не самую решающую роль в медицине настоящего века, поскольку его открытие облегчит исследования и лечение многих на­следственных заболеваний.