Таблица 57 - Определение типа токсина С. perfringens в реакции
Реакции нейтрализации
Таблица 56 - Идентификация токсинов С. perfringens в
Таблица 55 - Схема теста нейтрализации на мышах и интерпретация его результатов
Морских свинках
Таблица 54 - Схема постановки реакции нейтрализации на
Смеси фильтрата и | Тип токсина | |||||
антитоксических сывороток сывороток | А | В | С | D | Е | |
Необработанный | Бульон | + | + | + | ± | + |
фильтрат | Сыворотка типа А (анти-альфа) | - | + | + | (-)*± | ± |
Сыворотка типа А + С (антиальфа и анти-бета) | - | (-)*± | - | (-)*± | ± | |
Сыворотка типа А + С + D (анти-альфа, анти-бета, анти-эпсилон) | - | - | - | - | ± | |
Бульон | ± | + | (-)± | + | + | |
Трипсинизиро- | Сыворотки типа А | - | + | (+)± | + | + |
ванный фильтрат | (анти-альфа) | |||||
Сыворотки типа А + D (анти-альфа, анти-эпсилон) | - | (-)± | (-)± | - | + | |
Сыворотки типа А + С + D (анти-альфа, анти-бета, анти-эпсилон). | - | - | - | - | + | |
Сыворотка типа А + Е (анти-альфа, анти-йота). Обычно не ставят из-за редкого присутствия йота-токсина | - | + | (-)± | + | - | |
Индентифицируемый токсин | α | β+ έ | β | έ | i |
(-) * — почти всегда отрицательная, так как эпсилон-токсин находится в форме протоксина. (-) — почти всегда отрицательная, так как бета-токсин разрушается трипсином.
|
|
Испытуемая жидкость (мл) | Типовая антисыворотка (мл) | Объем смеси, вводимый мышам (мл) | Количество мышей |
0,9 | 0,3 А | 0,4 | |
0,9 | 0,3 В | 0,4 | |
0,9 | 0,3 С | 0,4 | |
0,9 | 0,3 D | 0,4 | |
0,9 | 0,3 Е | 0,4 | |
0,9 | Нет | 0,4 |
Интерпретация результатов, полученных в течение трех дней:
1. Антитоксин А нейтрализует только гемологический токсин.
2. Антитоксин В нейтрализует токсины А, В, С и D.
3. Антитоксин С нейтрализует токсины А и С.
4. Антитоксин D нейтрализует токсины А и D.
5. Антитоксин Е нейтрализует токсины А и Е. Эти данные представлены в таблице 56.
Антитоксическая сыворотка | Тип токсина | ||||
А (альфа) | В (альфа, бета, эпсилон) | С (альфа, бета) | D (альфа, эпсилон) | Е (альфа, йота) | |
А антиальфа | - | + | + | + | + |
В антиальфа, -бета, -эпсилон | - | - | - | - | + |
С антиальфа, -бета | - | + | - | + | + |
D антиальфа, -эпсилон | - | + | + | - | + |
Е антиальфа, -йота | - | + | + | + | - |
+ гибель; - гибель отсутствует
В соответствии с «Методическими указаниями...» в лабораториях РФ реакцию нейтрализации рекомендуется проводить путем смешивания в отдельных пробирках 1 мл антитоксических сывороток (А, С, D, Е), содержащих в 1 мл 10АЕ и 1 мл фильтрата. В пятой пробирке смешивают фильтрат и физиологический раствор. Компоненты инкубируют 30 минут при 37° С и по 0,5 мл смеси вводят двум белым мышам внутривенно (внутрибрюшинно) или морским свинкам (кроликам) по 0,2 мл внутрикожно. Результат учитывают в течение двух суток при гибели контрольных мышей или образовании некроза у контрольных животных и интерпретируют по схеме, представленной в таблице 57.
|
|
Тип С. perfringens | Токсин в исследуемом материале | Антитоксическая сыворотка | Контроль | |||
А | С | D | Е | |||
А | альфа | - | х | х | х | + |
В, С, F | бета | + | - | + | + | + |
D | эпсилон | + | + | - | + | + |
Е | йота | + | + | + | - | + |
Примечание к таблице 57
(+) — мыши пали, у морских свинок и кроликов некроз на месте введения;
(-) — мыши живы, у морских свинок и кроликов некроз отсутствует;
(х) — результат не учитывается
Выделение культуры С. perfringens, определение ее токсигенных свойств. С. perfringens является относительно аэротолерантным видом анаэробных клостридий. Температурный оптимум для типов А и D составляет 45° С, В и С — 37-45° С.
Согласно «Методическим указаниям...» в лабораториях РФ рекомендуется посев из содержимого кишечника и паренхиматозных органов делать на среду Кита-Тароцци с подавлением роста сопутствующей микрофлоры следующими способами. Применяют метод частых пересевов выросшей культуры с интервалом 2-3 часа на свежую среду Кита-Тароцци или засеянные пробирки прогревают при 65° С в течение 10 минут и затем культивируют 18 часов при 38° С. Рост С.perfringens в среде Кита- Тароцци — быстрый (3-8 часов), характеризуется помутнением, бурным газообразованием, образованием гомогенного или слизистого осадка. Из выросших культур делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Клетки С. perfringens в мазках из культуры выглядят как короткие, толстые, грамположительные палочки с обрубленными концами, жгутиков не имеют. В старых культурах клетки образуют центральные или субтерминальные споры. При незначительной контаминации культуры посторонней микрофлорой производят дробный высев на глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Посевы инкубируют при 37-38° С в течение суток.
С. perfringens на кровяном агаре формирует колонии трех типов диаметром 2-5 мм: S — гладкие, М — слизистые, R — махровые. Гладкие колонии первоначально напоминают капельки росы, затем прозрачность исчезает, колонии приобретают белую или сероватую окраску. Форма круглая, рельеф выпуклый, поверхность блестящая, гладкая, края ровные.
М-колонии формируют капсулообразующие клетки, они сходны с
S-колониями, но имеют слизистую консистенцию. Шероховатые колонии — неправильной формы, края фестончатые. По мере пребывания на воздухе колонии всех типов приобретают зеленоватый оттенок, что является характерным признаком. Колонии окружены зоной гемолиза, полного или частичного. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (действие гемолизинов), на отдалении — неполный (действие лецитиназы). Среда в процессе роста С. perfringens становится буро-коричневой.
Из типичных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроско-пируют. При обнаружении характерных для С. perfringens по морфологии и тинкториальным свойствам клеток культуру отвивают на среду Кита-Тароцци, выращивают 8-16 часов при 37-38° С и определяют в биопробе на мышах наличие токсина (методику см. выше).
Если предполагается наличие С. perfringens типов Е и D, токсин перед постановкой опыта на животных переводят из состояния протоксина в токсин. Предварительно культуру подщелачивают до рН 8,0-8,2, вносят 0,25% трипсина или 0,5% панкреатина и выдерживают, встряхивая, 2 часа при 37-38° С. При наличии токсина типа С токсичность снижается, В — сохраняется, D и Е — увеличивается. Тип токсина устанавливают в реакции нейтрализации, как указано выше. В настоящее время фирма Techlab Inc. выпускает диагностический набор для иммуноферментного выявления токсинов возбудителя в содержимом кишечника. Перспективно применение для идентификации токсичных штаммов С. perfringens ПЦР-диагностики.
|
|
С целью идентификации выделенных культур на видовом уровне изучают их ферментативные свойства. Для С. perfringens характерно наличие лецитиназы, желатиназы, казеиназы, способности расщеплять с образованием кислоты глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, свертывать молоко за 8-10 часов, при этом образуются прозрачная сыворотка и рыхлый сгусток казеина. Принимают во внимание, что штаммы типа А расщепляют инулин, но инертны по отношению к глицерину, типа Д утилизируют глицерин, но не инулин, типы В и С не разлагают оба эти углевода. Также используют тест-системы API 20A, Anacrotest 23 и др. С. perfringens — единственный вид клостридий, образующий капсулу, жгутиков не имеет.
Характер патологоанатомических изменений у морских свинок, зараженных подкожно, описан в разделе «Злокачественный отек».