Выделение и идентификация культуры возбудителя. Микроскопическое исследование исходного материала

Микроскопическое исследование исходного материала

Бактериологическое исследование

Лабораторная диагностика гемофилезного полисерозита

Питательные среды

Элективная питательная среда для первичной изоляции P. multocida. К расплавленному и остуженному до 45°С агару Хоттингера добавляю! клиндамицин из расчета 2 мкг/мл, среду разливают по чашкам Петри.

Модифицированная элективная питательная среда Моррис. К кровяному агару с 5% крови овцы или крупного рогатого скота добавляют селективные компоненты в одной из следующих комбинаций: а) неоми-ннм 0,0025, теллурит калия — 0,0025, тиротрицин — 0,01, актидион — 0,1; б) неомицин — 0,0015, новобиоцин — 0,002, актидион — 0,1 (г/л).

Гемофилезный полисерозит (болезнь Глессера) — инфекционная болезнь поросят, проявляющаяся генерализованным серозно-фибринозным воспа­рением серозных оболочек (плевра, перикард, брюшина), менингитами, ар­тритами. У свиней более старшего возраста вызывает артриты и пневмонии или выступает как секундарный агент при энзоотической (микоплазмозной) пневмонии. Возбудитель — бактерия Haemophilus parasuis, относящаяся к роду Haemophilus семейства Pasteurellaceae. Распространено носительство H.parasuis у клинически здоровых свиней. Лабораторная диагностика основана на результатах бактериологического исследования.

Стеерильно отбирают серозно-фибринозный экссудат из перитонеальной, плевральной, перикардиальной полостей, пораженных суставов, при нали­чии симптомов поражения — ЦНС-фрагменты тканей головного мозга, при наличии пневмонии — кусочки легких на границе пораженной и здоровой ткани. Материал транспортируют в термосе со льдом.

Из материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и одним из методов для выявления капсул. В патологическом материале возбудитель располагается в виде одиночных мелких грамотрицательных палочковидных бактерий, иногда небольшими скоплениями, короткими цепочками, клетки имеют капсулу.

Культивирование. H.parasuis — факультативный аэроб, температурный оптимум 37-38°С, рН 7,2-7,4. На обычных средах возбудитель не растет, требует добавления в среду готового фактора роста — V-фактор (NAD-никотинамидаденин-динуклеотид или NAD-фосфат NADP). В качестве источника V-фактора используют дрожжевой экстракт, энзиматически чистой NAD (NADP), гретую кровь барана (лошади) или растущую культуру «бактерий-кормилок», которая при этом выделяет в окружающую среду V-фактор, что обеспечивает возможность роста вокруг колоний «бактерий-кормилок» сателлитньгх мелких колоний H.parasuis. Стерильные дрожжевой экстракт и чистый NAD добавляют в МПА, МПБ, агар и бульон Хоттингера. Рост H.parasuis также зависит от наличия в среде сыворотки крови (барана, лошади, крупного рогатого скота), которую добавляют в питательную среду в количестве 8-10%. Для первичного выделения возбудителя лучше всего использовать кровяной агар (5- 10% дефибринированной крови барана, лошади, кролика) с «бактерией-кормилкой». При исследовании контаминированного материала применяют среды Controni.

Кровяной агар слегка подсушивают. Исследуемый материал засевай! шпателем (бактериологической петлей) по всей поверхности среды. Затем по диаметру чашки в виде двух прямых линий под углом 90° засевав бактериологической петлей культуру негемолитического штамма стафилококка или Е. coli («бактерия-кормилка»).

На плотные и жидкие питательные среды, содержащие готовые ростовые факторы (NAD, дрожжевой экстракт, гретую кровь), материал засевают обычным способом. Посевы культивируют при 37-38°С в течение 24 - 48 часов в аэробных условиях.

Характер роста Н. parasuis на питательных средах. На кровяном МПА возбудитель растет в виде мельчайших негемолитических колоний на расстоянии не более 1,0-3 см от штриха «бактерии - кормилки» (зона диффузии V-фактора). Вблизи «кормилки» колонии возбудителя крупнее, по мере удаления — мельче, так как снижается концентрация ростового фактора. Такой рост H.parasuis на кровяном агаре называют «сателлитным».

На прозрачном сывороточном МПА с «бактерией-кормилкой» колонии прозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистой консистенции, флуоресцирующие в косопроходящем пучке света.

На агаре с гретой кровью («шоколадный агар») в первичных посети можно наблюдать колонии двух типов: крупные — диаметр 1,5-2,5 мм и мелкие 0,2-0,5 мм. Морфология колоний лучше различима на прозрачных питательных средах типа агара Левинталя, сывороточно-дрожжевого агара. Колонии на этих средах имеют правильную круглую форму. Они выпук­лые, с гладкой поверхностью, ровными краями, слизистой консистенции, прозрачные, флуоресцирующие в косопроходящем свете. В процессе пассажирования возбудителя на питательных средах в результате диссоциации колонии могут терять свойство флуоресценции.

В жидких питательных средах (бульон Левинталя, сывороточно-дрожжевой бульон) Н. parasuis растет с легким равномерным помутнением среды, через 48-72 часа среда просветляется, на дне пробирки формируется слизистый осадок.

Морфология клеток возбудителя в культуре. Из выросших культур готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, нa капсулы — по Гинсу, препарат «раздавленная капля» для определения подвижности.

Морфология клеток H.parasuis такая же, как и в патологическом мате-шк, но часто обнаруживаются нитевидные формы. Клетки имеют капсулу, не образуют жгутики.

Идентификация H.parasuis на уровне рода. С целью отнесения выделенной культуры к роду Haemophilus, в первую очередь определяют морфологические, тинкториальные, культуральные признакаки и зависимость роста от NAD, а также подвижность, способность расти на средах с 0,5% NaCI, агаре Мак-Конки, образовывать каталазу, оксидазу, фосфатазу, ферментировать глюкозу, дульцит, гидролизовать твин-80. На практике идентификацию возбудителя, исходя из патолого-анатомических данных, сразу ведут на видовом уровне, придавая первостепенное значение определению NAD-зависимости.

Идентификация H.parasuis на видовом уровне. При видовой идентификации, исходя из происхождения исследуемого материала (свинья), Н. parasuis приходится дифференцировать от NAD-зависимых культур Actinobacillus pleuropneumoniae.