Лабораторная диагностика ящура

Таблица 104 - Параметры лунок, рекомендуемые для постановки РИД

Показатели	1 вар	2 вар
Диаметр центральной лунки для антигена мм
Диаметр периферических лунок для сыворотки мм
Расстояние между центральной и периферической лунками мм

Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностиче­ский набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке Е-1; референтная сыворотка Е-4, раз­веденная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как поло­жительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Рефе­рентные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Да­нии (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагно­стических наборов для постановки РИД и ИФА.

Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки кро­ви которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС.

Описаны модификация метода иммунодиффузии - усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления AT и АГ ВЛКРС. Со­временная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекоменда­ций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежно­сти результатов югославские исследователи уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста.

Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ. Молдав­скими исследователями показано значительное преимущество РИД при исследовании молозива: титр AT был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови; исследовать необходимо первые порции молозива. Аналогичные данные получены сотрудниками ВИЭВ. Титр AT к gp51 и р24 ВЛ КРС сразу после отела был наивысшим - 1:2187-1:59049 в ИФА и 1:16-1:512 в РДП. Через 1 сут титр AT составлял 25% от исходного.

РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использовать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями. Животные, сыворотки крови которых дали положительную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Данная реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов. Испытание этой реакции показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологическими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС.

ИФ. Менее широко применяют для обнаружения AT в сыворотках крови инфицирован­ных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, иронически инфицированные ВЛКРС.

РНГА. Является чувствительным методом обнаружения AT в сыворотке крови и молоке. Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока. Наибольший Процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследо­ваний был отмечен в РНГА.

ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широко­масштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше, чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувст­вительность серодиагностики по сравнению с РДП. Он удобен для систематического кон­троля молока коров благополучных хозяйств.

ELISA с монАТ ставят с пулом сывороток крови, объединенных от животных одного стада. Предложено выявлять инфицированность ВЛКРС по наличию AT в молозиве коров ELISA. Все образцы молока, взятые от больных коров, позитивных по AT к вирусу в сыво­ротках, оказались положительными. Во ВНИИВиМ получены 6 гибридом, секретирующих монАТ к ВЛКРС. На основе мон AT к gp51 предложен "сэндвич" вариант ИФА для выявле­ния вирусного АГ. Установлено, что структура и доступность антигенных детерминант варьирует в разных системах титрования. Внесение радиоактивной метки может изменять конфигурацию АГ сайтов, что сказывается на результатах исследования сывороток. Анти ВЛ КРС AT конкурировали со специфическим пероксидазным конъюгатом на основе монАТ за связывание с gp51.

Первым этапом в постановке "классического " варианта ИФА для выявления AT против ВЛКРС является непосредственное покрытие лунок микропанелей вирусным АГ. При этом получают большой процент ложноположительных результатов из-за неспецифического взаимодействия невирусных компонентов АГ с испытуемыми сыворотками. Более того, ис­пользование очищенных вирусных белков в качестве АГ экономически неоправданно и не позволяет получать стандартный препарат, что сказывается на воспроизводимости результа­тов ИФА. Поэтому в настоящее время почти все наборы для постановки ИФА изготавлива­ются с использованием захвата AГ AT, сорбированными на стенки лунок микропанелей. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции.

Этап I. Реагенты для захвата АГ: а).монАТ против gp51; б).монАТ против р24; в).Поликлональные AT (gp51+p24) КРС. Этап 2. Антиген:
а) надосадочная жидкость после культивирования клеток FLK-BLV;
б) культуральная жидкость, содержащая продукты генов env или gag ВЛКРС, экспрессируемые рекомбинантными векторами. Этап 3. Испытуемые сыворотки. Этап 4. Реагенты для обнаружения иммунного комплекса.

Непрямые варианты ИФА: монАТ против бычьего IgG; полиАТ против бычьего IgG.

Конкурентный или блокирующий варианты ИФА: а) монАТ против gp51 (направленные против других эпигонов нежели использованных на этапе 1a); 6) Бычьи поликлональные AT (такие, как на этапе 1в)

Этап 5. Цветная индикация. Реагенты для индикации иммунного комплекса (этап 4) можно метить биотином или ферментами, чаще используют пероксидазу хрена. При поста­новке ИФА каждая микропанель должна содержать лунки, заполненные положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

ИФА позволяет выявлять AT в титрах в 10-100 раз меньших, чем обнаруживает РИД. Все коммерческие наборы ИФА должны быть стандартизированы по референтной сыворот­ке Е-4. Причем, процедура стандартизации предусматривает 3 возможных варианта исполь­зования наборов ИФА для исследования: 1) индивидуальных проб сыворотки; 2) индивиду­альных проб молока; 3) пулов сыворотки и молока.

Поскольку в молоке AT к ВЛКРС в 25 раз больше, чем в сыворотке крови, модифици­рованный ELISA должен обладать высокой чувствительностью. При диагностике лей­коза КРС качество используемых диагностикумов имеет первостепенное значение. Наиболее пригодным для ИФА в качестве АГ являются препараты вируса, полученные 2-кратным вы­сокоскоростным центрифугированием и синтетический пептид. В Швеции разработан ELISA для исследования молока и сывороток крови. В Бельгии рекомендован конкурент­ный ELISA с использованием монАТ и меченного пероксидазой конъюгата анти-gpS 1. МонАТ Д9 и F11 против лимфоцитов больных лейкозом животных связываются с АГ лим­фоцитов крови больного КРС, «не распознают» АГ, ассоциированные с лейкозом. ELISA с использованием монАТ, превосходит непрямой тест ELISA.

Параллельно с ИФА AT определяли РИД и электрофореза в полиакриламидном геле. Чувствительность ИФА, испытанного в 5 лабораториях Германии, составляла в среднем 97,6%, что в 4 раза выше РИД. Специфичность ИФА равнялась в среднем 98,1 %. При использовании АГ из культуральных жидкостей клеток почки эмбриона ягнят, персистентно инфицированных ВЛКРС в положительных сыворотках с помощью иммуноблотинга, обна­руживали AT к р24, р15, р12, pl0, gp30, и gp51. В иммуноблотинге оказались активными монАТ к р24 и gp51. Данный метод оказался более чувствительным, чем иммунодиффузия в агаровом геле и ИФА. В ИФА возможно использование синтетических пептидов -фрагментов структурного гликопротеина gp51, синтезированных во ВНИИЗЖ.

Аллергическая реакция. Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберку­леза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного узла (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще поражения в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжееч­ных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильт­раты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лим­фоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди них гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бакте­рии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА и аллергической пробы.

Ящур - остро протекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени; у молодых животных - поражением миокарда и скелетных мышц.

Возбудитель: РНК - содержащий вирус, относящийся к роду Aphthovirus,сем. Picornaviridae, имеющий 7 серологических типов (О, А, С; SАТ-1, SАТ-2, SАТ-3, Азия-1). Вирион вируса имеет форму икосаэдра, размером диаметра 25 нм, содежит 31% РНК и 69% белка. В организме естественно восприимчивых животных вирус индуцирует образование типоспецифических ВНА, КСА и ПА. Резистентность переболевших животных к повторному заражению связана с титром ВНА. Вирус ящура устойчив во внешней среде, особенно в высушенном состоянии, при сухом воздухе, отсутствии света, при пониженной температуре. Так, при влажности 30-40% и температуре 18⁰С высушенный вирус сохраняется в течение 2 лет.

Лабораторная диагностика ящура основана на эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, патологических изменениях и лабораторных исследованиях. Подозрение на ящур вызывает любое заболевание восприимчивых животных, характеризующееся появлением везикулярной сыпи в ротовой полости, на конечностях и вымени, повышенной саливацией, чмоканьем, затрудненным приемом и пережевыванием корма, а при осмотре ротовой полости - обнаружением афт и эрозий. Кроме того, обращают внимание на продолжительную яромоту, афты на венчике и в области межкопытной щели, иногда спадение рогового башмака, афты на сосках и болезненность последних при доении и сосании с сильно выражен­ным защитным рефлексом.

Эпизоотологический диагноз - высокая контагиозность, избирательное поражение только парнокопытных. Методы лабораторной диагностики ящура варьируют в зависимости от того, необходимы ли раннее обнаружение и типовая (вариантная) идентификация вируса (ранняя диагностика) или обнаружение и идентификация специфических противоящурных АТ у животных-реконвалесцентов (ретроспективная диагностика).

Лабораторная диагностика основана на выделении вируса, индикации, идентификации и типировании вируса ящура.

Выделение вируса. Эффективность выделения вируса из патологического материала повышается при использовании методов очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий. Благодаря удобству выполнения, экономичности, а главное, возможности быстрого получения результатов, позволяющих одновременно определить типовую и вариантную принадлежность эпизоотического вируса, чаще всего применяют РСК или РДСК. Однако, когда доставленное количество вирусного материала недостаточно для исследования или РСК дает отрицательный результат или неспецифическую задержку гемолиза, то ставят боиопробу на КРС (не менее 2 голов) в возрасте 18 мес, вводя 0,1 мл суспензии полученного; материала в несколько точек слизистой оболочки языка и мякишей конечностей; общий объем испытуемого материала 2-3 мл. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением в РСК свидетельствует о наличии ВЯ. Однако метод дорог и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому в диагностической практике он применяется очень редко. Чаще для биопробы используют мышат-сосунков 4-6-дн возраста, морских свинок массой не менее 500 г и первичную культуру клеток почек телят, поросят, ягнят, щитовидной железы КРС и перевиваемые клетки - ВНК-21, IB-RS-2. Биопроба на мышах удобна и экономична. ИД₅о испытуемого штамма на мышатах-сосунах и крупном рогатом скоте одинаковы. Мышата-сосуны более чувствительны к вирусу ящура, чем морские свинки. Однако необходимо иметь в виду, что оценка результатов титрования на мышатах-сосунках нередко затруднительна.

Морские свинки легко заражаются при интрадермальном введении вируссодержащего материала в плантарную поверхность задних лапок в дозе 0,2-0,5 мл. Заражают не менее 5 голов. Первичные поражения обычно появляются через 2-5 дн (по мере созревания). Вторичные поражения - везикулы в ротовой полости - обычно развиваются при заражении штаммами, адаптированными к морским свинкам.

Для выделения вируса чаще всего используют культуру первично-трипсинизированных клеток почек свиней или телят. Наблюдение за инфицированными культурами клеток ведут 7 дн, микроскопируя их ежедневно. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении её специфичности в РСК свидетельствует о наличии ВЯ в испытуемом материале.

Индикация и идентификация вируса. В качестве экспресс-метода в настоящее время широко применяется ПЦР. Это быстры и чувствительный метод обнаружения ВЯ в тканях путем энзиматической амплификащи РНК гена полимеразы.

РСК по 100%-ному гемолизу. Применяется для определения типов и подтипов (вариантов) ВЯ, вызвавших заболевание животных, а также для проверки производственных штаммов ВЯ при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно-исследовательской работе.

Антигенное родство (R) более 70% свидетельствует о том, что штаммы по антигенным свойствам идентичны друг другу и относятся к одному и тому же варианту, от 10 до 70% - к различным вариантам (подтипам) и менее 10%- к различным типам.

РСК по 50%-ному гемолизу. Успешно применяют в работе научно-исследовательских лабораторий и учреждений биологической промышленности. Разработан способ изучения иммунного статуса вакцинированных против ящура животных в РСК. Он позволяет спе­циалистам на уровне областных ветлабораторий проводить мониторинг за иммунным со­стоянием стад в простой и достоверной реакции.

РПГА. Это простой, ускоренный, чувствительный метод идентификации ВЯ. По чувст­вительности реакция превосходит общепринятый метод типирования ВЯ в РСК в 8-16 раз. Сущность её заключается в том, что нагруженные AT эритроциты агглютинируются при контакте с ящурным АГ гомологичного типа.

Типирование ВЯ. Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета. Испытание перекрестно­го иммунитета на КРС с целью определения типовой принадлежности полевого штамма ВЯ проводится лишь в том случае, если по лабораторным тестам обнаруживается новый тип ВЯ, ранее не встречавшийся в стране. Определение типа ВЯ методом перекрестного имму­нитета возможно и на морских свинках.

Штаммы считают идентичными, если вакцина предохраняет животных от развития генерализованного процесса при заражении используемыми штаммами. В случае иммуноло­гического отличия штаммов вакцинированные животные, инфицированные гетерологичным штаммом, заболевают генерализованной формой ящура.

При определении в культуре леток типа ВЯ его относят к тому типу, сыворотка против которого предотвращает ЦПД. Разработан вариант универсальный эритроиммуноадсорбции (УЭИА), позволяющий определять АГ ВЯ в более высоких титрах, чем в РСК и РПГА.

ИФА. Высокоэффективен для выявления как 146S-, так и 125-компонентов ВЯ. Этот метод в 500 раз чувствительнее РСК при исследовании проб афтозного эпителия. Установ­лена высокая степень специфичности и чувствительности ELISA для идентификации и типирования ВЯ всех 7 серотипов в эпителиальных тканях. Установлена высокая чувстви­тельность сэндвич-варианта ИФА (на основе щелочной фосфатазы), который по эффектив­ности превосходит в 207-219 раз, а с хромогенными субстратами - в 4-64 раза.

ИФА может быть пригодной в системе лабораторной диагностики ящура при исследо­вании диагностических штаммов. Для выявления AT к ВЯ в ИФА можно использовать про­бы крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Первоначальный объем гепаринизированной крови равен 7,65 мкл.