Микроскопия в ультрафиолетовом свете

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение. Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от обычного светового микроскопа в основном следующим:

1. Наличие мощного источника света в осветителе, изучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа).

2. Наличие системы светофильтров:

1. возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;

2. теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа.

3. «запирающие» светофильтры расположены перед окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

Эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции -

освещение светом, падающим через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объективов, имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква «Л». При работе с объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло.

Поскольку клетки и большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе.

Флюорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (аурамин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами и др. Этот же способ может применяться для цитохимического изучения живых и фиксированных клеток и микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, флюоресцирует зеленым, а с РНК – красным).

Наиболее широко используются реакции иммуннофлюоресценции, когда светятся белки, с которыми связываются антитела, меченных флюорохромами (ФИТЦ и др.). Методом иммунофлуоресценции выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных, различные белки в клетках.

Метод иммунофлуоресценции в последние годы стал рутинным в медико-биологических исследованиях, поскольку он позволяет визуализировать самые разнообразные структуры в клетках: клеточные белки, микроорганизмы, вирусные включения.

Недостатки флуоресцентной микроскопии: флуоресценция заливочной среды; флуоресценция толстых объектов вне фокуса.

Конфокальная микроскопия позволяет визуализировать флуоресцирующие молекулы в одной плоскости (плоскости фокуса). Лазерный луч быстро сканирует объект, захватывая очень маленькие участки, что обеспечивает сильное увеличение и хорошее качество изображения. Изображение передается на компьютер.

Deconvolution (обратная свертка, деконволюция) microscopy, как и конфокальная микроскопия, генерирует изображение поперечного среза, однако, делает это иначе. В обоих случаях объективная линза собирает свечение в плоскости фокуса, за и перед этой плоскостью. Конфокальный микроскоп избавляется от избыточного свечения тем, что используется очень маленькая площадь обзора, фактически точечная. Напротив, деконволюционная мироскопия собирает весь свет, из разных фокальных плоскостей, а затем путем математической обработки перераспределяет «внефокусный» свет в реальную плоскость и формирует изображение на компьютере, используя математическую операцию деконволюции.

Для понимания, как работает деконволюционный микроскоп, представим бесконечно малый источник флуоресценции, меньше чем разрешение светового микроскопа (<0,2 мкм в диаметре). Испускаемое свечение распространяется во всех направлениях, и когда источник находится в плоскости фокуса, мы видим яркую светящуюся точку. Когда источник будет вне плоскости фокуса, мы будем видеть гало. По мере удаления фокальной плоскости от источника, гало будет больше и выглядеть более диффузно. Зная, как свет, испускаемый бесконечно малым источником, собирается и искривляется образцом и микроскопом, можно реконструировать изображение объекта, находящегося в фокусе, используя набор изображений, полученных при перемещении плоскости фокуса через интересующую нас плоскость образца.

Изображение в дек. микроскопе может быть более детальным, чем в конфокальном. Кроме того, свечение для исследования в этом микроскопе может быть не таким сильным, поскольку собирается весь свет, испускаемый объектом. Трехмерное изображение может быть получено с помощью дополнительной обработки, так называемых оптических срезов. Компьютер при этом записывает изображения, формируемые в серийных плоскостях и формирует единое трехмерное изображение.

При всех достоинствах, иммунофлуоресцентная микроскопия ограничена в возможностях. Позволяя выявлять отдельные типы молекул, она не в состоянии визуализировать остальные структуры. При исследовании тканей и органов возникает необходимость дополнительного светооптического исследования.

Очень важным и полезным было открытие зеленого флуоресцентного белка (Green Fluorescent Protein, GFP). Этот белок существовал более 100 млн. лет в медузах одного вида Aequorea victoria, у которых он и был найден в фотооргане, расположенном вблизи щупалец. Нужно отметить, что GFP не связан со свечением медуз на фотографиях, оно обусловлено отражением вспышки фотоаппаратф и не является флуоресценцией.

GFP – небольшой белок, 26,9 kDa, дает яркую зеленую флуоресценцию при облучении ультрафиолетовым или синим светом. Был выделен в 1962 г. Osamu Shimomura с сотрудниками из медузы Aequorea victoria ( Акворея виктория), также иногда называемая кристаллической медузой, это - биолюминесцентная гидроидная медуза. В 1992 г. GFP был впервые клонирован, а вскоре было показано, что ген GFP встроенный в другие организмы, экспрессируется и дает флуоресцирующий белок. Соответственно, сцепленный с другими генами, при совместной экспрессии, белки визуализируются в клетках и тканях. В 2008 г. Osamu Shimomura, Marty Chalfie, и Roger Tsien получили Нобелевскую премию по химии «за открытие и применение GFP».

В последние годы появилось огромное количество мутантов GFP, с различными параметрами свечения, яркости и цвета, сниженной диффузией внутри клеток и т.д. Белки GFP используются для визуализации клеток и клеточных структур, а также в качестве репортеров при трансфекции и оценке экспрессии рекомбинантов.