2015-02-27
1267
Принцип метода. Для оценки аффинности необходимо определение свободного (с) и связанного (в) гаптена. Иммуноглобулины осаждаются в мягких условиях из раствора при 33-55% насыщения сульфатом аммония без потери сродства к гаптену. Затем измеряется количество гаптена, связанного находящимися в осадке антителами и свободного гаптена в надосадочной жидкости.
Методика. Используют очищенные антитела или антисыворотку.
Очищенные антитела растворяют в нормальной сыворотке, разведенной в соотношении 1:5 или 1:10, обладающей низким сродством к соответствующему гаптену. Исследуемые антисыворотки также разводят в соотношении 1:5 или 1:10.
К 50 мкл раствора антител приливают пипеткой 50 мкл раствора гаптена.
В качестве контроля неспецифического связывания используют нормальную сыворотку в разведении 1:5 или 1:10.
В зависимости от необходимой точности определения аффинности применяют 5-20 различных концентраций гаптена, охватывающих область концентраций трех порядков (например, от 10-5М до 10-7М). Оба компонента тщательно перемешивают и выдерживают при 4ºС в течение 1 часа. Затем прибавляют равный объем (100 мкл) насыщенного раствора сульфата аммония при температуре 4ºС и немедленно перемешивают, чтобы избежать денатурации антител. После 30-минутной инкубации при 4ºС, в течение которой дважды проводят кратковременное встряхивание, пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 5000 об/мин при той же температуре. Надосадочную фракцию в количестве 100 мкл, в которой определяют концентрацию свободного гаптена, переносят в 10 мл сцинтиллятора. Измеряют радиоактивность образца с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Количество свободного гаптена (с) определяют непосредственно по радиоактивности материала. Количество связанного с антителами гаптена (в) вычисляют по разности между радиоактивностью надосадочной фракции раствора, содержащего специфические антитела, и раствора, содержащего нормальную сыворотку. Если концентрация антител известна то, в может быть преобразовано в молярное соотношение Г/АТ.
