Работа 1. Изучить функционирование ЦТК по убыли ацетил –КоА

Принцип метода: первым этапом ЦТК является реакция конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом, которая осуществляется цитратсинтазой. Образовавшаяся лимонная кислота подвергается превращению в цикле трикарбоновых кислот, а освободившийся КоА-SH можно определять, используя реактив Фолина (появляется синее окрашивание). Если блокировать ЦТК малоновой кислотой, то ацетил-КоА не используется и КоА-SH не образуется.

Материальное обеспечение:

Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, раствор оксалоацетата, раствор малоновой кислоты, физиологический раствор, гомогенат митохондрий, реактив Фолина А, реактив Фолина В, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт

1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0 мл 2,0 мл

2. Р-р ацетил –КоА 0,5 0,5

3.. Р-р оксалоацетата 0,5 0,5

4. Р-р малоной кислоты 1,0 -

5. Физиологический р-р - 1,0

6. Гомогенат митохондрий 0,5 0,5

Инкубация 10 минут при комнатной температуре.

7. Реактив Фолина А 0,5 0,5

8. Реактив Фолина В 0,5 0,5

Результат (окраска растворов).

Выводы: 1. Напишите исследуемую реакцию ЦТК

2. Приведите реакцию ЦТК, которая ингибируется малоновой кислотой. Сравните формулы субстратов и малоната.

3. Определите тип ингибирования.

Работа 2. Изучить функционирование ЦТК по образованию углекислого газа.

Принцип работы: при окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется углекислый газ, который связывается гидроксидом кальция и определяется при добавлении серной кислоты по выделению пузырьков газа.

Материальное обеспечение:

Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, раствор оксалоацетата, раствор малоновой кислоты, физиологический раствор, гомогенат митохондрий,, раствор Са(ОН)_2,0,1 н серная кислота, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт

пп___________________________________________________________________________

1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0 мл 2,0 мл

2. Р-р ацетил-КоА 0,5 0,5

3. Р-р оксалоацетата 0,5 0,5

4. Р-р малоновой кислоты 1,0 -

5. Физиологический р-р - 1,0

6. Р-р Са(ОН)₂1,0 1,0

7. Гомогенат митохондрий 0,5 0,5

Инкубация 10 минут при комнатной температуре.

8. 0,1 н.р-р серной кислоты 1,0 1,0

Результаты (выделение углекислого газа).

Выводы: 1. Напишите реакции ЦТК, которые сопровождаются выделением СО₂

Работа №3 Изучить функционирование ЦТК по образованию атомов водорода.

Принцип работы: При окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется 8 атомов водорода, которые отщепляются при участии соответствующих дегидрогеназ, в качестве акцептора используется 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИ). Если цикл функционирует, то 2,6-ДХФИ восстанавливается и обесцвечивается.

Материальное обеспечение:

Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, гомогенат митохондрий, раствор ЩУК, 0,001н раствор ДХФИ, бидистилят, пипетки, пробирки.

Ход работы:

Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:

№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт

1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0мл 2,0мл

2. Р-Р ацетил-КоА - 0,5

3. р-р Щ У К - 0,5

4. Бидистиллят 1,0 -

5. 0,001 н. р-р ДХФИ 1,0 1,0

6. Гомогенат митохондрий 1,0 1,0

Инкубация 15-20 минут при комнатной температуре.