2015-04-30
875
1) Встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.
2) При агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокации фрагментов хромосом, что также может менять нормальное функционирование генома растения.
3) Проблема замолкания генов (gene silencing). Обнаружено, что у некоторых трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность, хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК.
Однако у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. Установлено, что чем больше копий трансгена и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Т.е., трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; а сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 п.н) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед трансформацией.
Уровень и стабильность экспрессии трансгенов в растении можно повысить при специальном конструировании концов вводимой ДНК. Так, добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания. При концевом добавлении сравнительно коротких (>300 п. н.) участков связывания ядерного матрикса, трансген имеет больше шансов образовать независимую петлю хроматина или включиться в состав транскрибируемого эухроматина. В обоих случаях это приводит к повышению и стабилизации уровня экспрессии трансгена.
В ряде случаев, особенно у злаков, введение интрона в район 5'-конца мРНК целевого гена резко усиливает его транскрипцию.
Уровень транскрипции введенного гена Стабильно введенный ген должен передаваться потомству при семенном размножении, поэтому важно определить этот параметр на практике. Оценивается он обычно с помощью традиционного Northern-блоттинга или ПЦР (на мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная цепь ДНК, которая и размножается в полимеразной цепной реакции). В ряде случаев экспрессию гена контролируют по конечному белковому продукту или тому эффекту, который этот белок вызывает.
Исследование биобезопасности трансгенных растений. Факторы риска:
1) наличие во многих ТР генов устойчивости к антибиотику (в частности, к канамицину), которые содержались в исходной конструкции ДНК в качестве селективных.
Предполагается, что эти гены устойчивости могут при переваривании пищи передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы могут приобрести резистентность к данному антибиотику.
Вероятность такого события ничтожно мала - многочисленные эксперименты и наблюдения в природе относительно подобного горизонтального переноса генов до сих пор давали только отрицательные результаты. Встраиваемые в растения гены устойчивости "настроены" для экспрессии лишь в эукариотических, но не в бактериальных клетках. Эти селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике. Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем при употреблении трансгенных растений. В большинстве случаев маркерные гены устойчивости к антибиотикам сейчас заменяют на гены устойчивости к гербицидам. Правда, применение "гербицидных" генов также встречает возражения, но уже защитников окружающей среды. Предложено несколько способов избирательной элиминации маркерного гена после получения желаемого трансгенного растения, когда он фактически уже не нужен.
Очень перспективным представляется замена селективных генов на репортерные при отборе трансгенных форм растений, либо использование альтернативных селективных генов, таких как гены синтеза фитогормонов или гидролиза особых форм полисахаридов при выращивании растений в культуральной среде. Таким образом, даже эта виртуальная опасность, связанная с генами устойчивости к антибиотику, в скором времени перестанет существовать.
2) Токсичности или аллергенности трансгенных растений,
Здесь применяют те же жесткие стандарты, как и для полученных традиционным путем новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания. Никаких особых отличий трансгенных растений от обычных по этим параметрам ожидать не приходится (разве что в лучшую сторону при блокировании синтеза токсинов или аллергенов), да и действительно, как правило, не наблюдается на практике.
3) Возможный ущерб для окружающей среды. Во-первых, существует опасение, что устойчивые к гербицидам культурные растения могут при межвидовом опылении передавать эти гены близкородственным сорнякам, которые могут превратиться в неистребимые суперсорняки (superweeds).
В практике сельского хозяйства уже давно используется ряд устойчивых к гербицидам сортов, полученных путем обычной селекции. При этом никакой экологической катастрофы широкое использование таких устойчивых сортов до сих пор не вызвало.
В настоящее время в растения чаще вводят не один, а сразу несколько генов устойчивости к разным гербицидам. Передача нескольких генов сорнякам гораздо менее вероятна, чем одного гена. Кроме того, мультигербицидная устойчивость позволит чередовать разные гербициды при обработке посевов, что не даст возможности для распространения какого-либо определенного гена устойчивости в сорняках.
Предлагается также вводить гены устойчивости не в ядерный, а в хлоропластный геном. Это может предотвратить нежелательный дрейф генов с помощью пыльцы, так как хлоропласты наследуются только по материнской линии. Еще один генно-инженерный путь борьбы с сорняками без использования генов резистентности к гербицидам вообще – биотрансгенный. Речь идет об использовании мелких животных, например, кроликов, для поедания сорняков на полях. При этом, чтобы оградить от поедания культурные растения, в них можно ввести какой-либо ген, делающий их непривлекательными (запах, вкус) для данного животного. Такой биотрансгенный подход сразу снял бы большинство выдвигаемых сейчас возражений против трансгенных культур.
Близкие по сути экологические возражения касаются трансгенных растений со встроенными "инсектицидными" генами, способных, как считают, спровоцировать у насекомых-вредителей возникновение массовой резистентности. Для придания устойчивости к вредителям чаще всего используется ген Bt-токсина, выделенный из бактерии Bacillus thuringiensis. Препараты этой бактерии уже около 50 лет применяются в сельском хозяйстве в качестве безопасного для людей и животных биоинсектицида, но они быстро теряют активность, и поэтому их доля в мировом производстве инсектицидов составляет менее 2%. Токсин бактерии поражает кишечник вредителей, питающихся растениями, причём с очень высокой специфичностью. При встраивании гена растение начинает вырабатывать токсин самостоятельно. А значит, отпадает необходимость обработки культур опасными химическими инсектицидами.
Также предложены действенные способы для уменьшения этой опасности, например, использование генов нескольких разных токсинов и/или индуцибельных промоторов, быстро активирующихся при нападении насекомых на растение.
4) пыльца трансгенных растений может быть токсичной для полезных насекомых, которые данной пыльцой питаются. Некоторые экспериментальные данные говорят о том. что такая опасность действительно существует, хотя о ее возможных масштабах говорить пока трудно. Однако и здесь уже предложены и испытаны адекватные генно-инженерные решения, например, использование трансгеноза через хлоропластную ДНК, или промоторов, не работающих в пыльце.
В 2002 году 75% всех выращиваемых трансгенных растений содержали ген устойчивости к гербицидам, 17% — ген устойчивости к вредителям и почти 8% — по два гена устойчивости. Но сегодня приоритеты в создании растений, обладающих теми или иными признаками, изменились. Если в 90-е годы в основном работали над растениями, обладающими полезными свойствами для их выращивания, — именно они сейчас и возделываются на полях, — то в настоящее время основной упор делается на улучшение потребительских свойств. По прогнозам, такие улучшенные культуры сменят растения, синтезирующие медикаменты, а их, в свою очередь, — растения-продуценты специфических химических соединений.
