Окраска мазка

Клетки микроорганизмов окрашивают, главным образом, анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым красителям относятся те, у которых ион, придающий окраску (хромофор) - анион. У основных красителей хромофором является катион. Примером кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин. Все эти красители интенсивно связываются с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин - более интенсивно связываются с ядерными (кислыми) компонентами -клетки.

Различают простые и дифференцированные способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. При дифференциальной окраске в большинстве случаев окрашивается не вся клетка, а лишь определенные ее структуры. Последний способ окраски используют для изучения некоторых клеточных структур, а также для характеристики и идентификации микроорганизмов.

1. Устройство микроскопа МБР-1

Световые микроскопы позволяют исследовать объекты в проходящем свете. Наиболее распространены биологические микроскопы типа МБР-1(рис. 1.2.), Биолам, МБИ-1.

Механическая часть микроскопа включает штатив с предметным столиком (2) и тубус (16). Предметный столик может перемещаться в горизонтальный плоскости с помощью двух винтов (3), находящихся справа и слева. Это дает возможность перевести любую точку препарата в центр поля зрения. На поверхности столика имеются две клеммы (4), зажимающие препарат. Под предметным столиком на штативе укреплен кронштейн конденсора (6). Верхняя часть штатива – тубусодержатель (11) – может перемещаться с помощью механизма, вмонтированного в основании штатива. Этот механизм приводят в действие вращением макрометрического (12) и микрометрического (13) винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки исследуемого объекта. При вращении этих винтов по часовой стрелке тубусодержатель опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается. В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер (14), в отверстия которого ввинчиваются объективы (15), и гнездо для крепления тубуса. Наклонный тубус микроскопа можно повернуть вокруг вертикальной оси в любое удобное положение и закрепить винтом (17). В верхний конец тубуса вставляется окуляр (18).

Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат, объектив и окуляр.

Осветительный аппарат состоит из конденсора (5) и зеркала (10) и предназначен для наилучшего освещения препарата. Конденсор укреплен винтом (7) над зеркалом и состоит из нескольких линз. Он собирает параллельные лучи, идущие от источника света и отраженные зеркалом, в одной точке – фокусе, который должен находиться в плоскости препарата. Конденсор вместе с оправой может перемещаться вертикально специальным винтом (8). Регулируемое зеркало, вогнутое с одной стороны и плоское с другой, укреплено у основания штатива. При работе с конденсором, который рассчитан на фокусировку параллельных лучей, пользуются только плоской стороной зеркала. Вогнутое зеркало используют в тех случаях, когда работают без конденсора. Оно собирает пучок параллельных лучей, идущих от источника света, и фокусирует его в плоскости препарата.

Рис. 1.2. Микроскоп МБР-1

Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он дает действительное увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Самая главная – наружная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зависит увеличение объектива.

Объективы различают сухие и погруженные – иммерсионные (водные, масляные). Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и рассматриваемым объектом находится слой воздуха. Иммерсионными называются объективы, фронтальная линза которых при работе погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла (1,53). В качестве иммерсионной жидкости используют кедровое масло (показатель преломления 1,515), иногда вазелиновое. Световые лучи при переходе из стекла в слой иммерсионного масла не преломляются и, не отражаясь, попадают в объектив, таким образом достигается наилучшее освещение рассматриваемого предмета.

Микроскоп МБР-1 имеет объективы, увеличивающие в 8, 40 и 90 (иммерсионный) раз. От увеличения объектива зависят еще две его характеристики: рабочее расстояние, т.е. расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объекте, и площадь поля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем меньше его рабочее расстояние и поле зрения.

Окуляр микроскопа представляет собой оптическую систему, состоящую из двух линз: глазной (верхней) и собирательной (нижней). Назначение окуляра состоит в увеличении того изображения, которое дает объектив. Имеются окуляры, увеличивающие в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз. Увеличение окуляра указано на оправе, например,15^х.

Общее увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра (например, 90х7=630 раз).

Четкость получаемого изображения характеризуется разрешающей способностью микроскопа, определяемой минимальным (разрешающим) расстоянием между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну.

Хорошие результаты при работе с микроскопом могут быть получены только при условии правильного освещения объекта. Установку света выполняют в такой последовательности:

1. Ставят микроскоп на необходимое расстояние от источника света.

2. Устанавливают объектив 8х.

3. Поднимают конденсор вверх до упора так, чтобы верхняя линза конденсора находилась в одной плоскости с предметным столиком микроскопа.

4. Глядя в окуляр и поворачивая зеркало, находят в поле зрения изображение краев диафрагмы осветителя, которое имеет вид светлого пятна с нечеткими краями. Величина пятна зависит от степени раскрытия диафрагмы осветителя и положения объектива. Чем шире открыта диафрагма и чем выше объектив, тем больше пятно. Если оно занимает значительную часть поля зрения, уменьшают его, несколько опустив объектив, глядя при этом в окуляр. В тех случаях, когда пятно сдвинуто к краю поля зрения, его переводят в центр осторожным поворотом зеркала. По ряду причин (отсутствие точечного источника света) под микроскопом чаще всего видно не одно пятно, а несколько четких пятен. Установку света осуществляют по центральному пятну.

5. С помощью зеркала переводят яркое пятно в центр поля зрения. Если пятно освещено неравномерно, добиваются его равномерного освещения, слегка поворачивая корпус осветителя. При необходимости пятно снова центрируют.

6. Препарат помещают на предметный столик.

7.Используя объектив 8х, фокусируют объект в области светлого пятна. Находят объект исследования.

8. Устанавливают объектив 40х, фокусируют объект в области светлого пятна.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1975.160 с.

2. Практикум по микробиологии /Под ред. Н.С. Егорова М.: Изд-во Моск.ун-та,1976. 307 с.