Лабораторная работа № 10.
Изучение ферментов дыхания растений
Цель работы: провести экспериментальное определение активности основных дыхательных ферментов.
Опыт 1. Определение каталазы.
Объектом исследования могут послужить листья элодеи или прорастающие семена различных растений.
Ход работы:
1. В пробирку помещают 10-20 штук проросших семян гороха, вносят 3% раствор перекиси водорода. Через некоторое время наблюдают выделение пузырьков газа. Аналогичный опыт ставят с семенами, предварительно убитыми кипячением.
2. На предметное стекло помещают лист элодеи, наносят на лист 3-4 капли 3% перекиси водорода и наблюдают препарат под микроскопом. Аналогичный опыт ставят с листом. Убитым кипячением.
Задание: сделать вывод о наличии активности каталазы в живых и мертвых тканях.
Опыт 2. Определение активности каталазы газометрическим методом.
Каталаза относится к оксидазам, окисляющим субстрат кислородом перекиси водорода. Но главная функция каталазы – расщепление перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Ядовитый для живых тканей продукт обмена веществ Н2О2 обезвреживается при участии каталазы. По химической природе каталаза – гемопротеид. Содержится она во всех тканях и органах растений, но активность её различна и часто коррелирует с активностью процессов жизнедеятельности организма.
|
|
Принцип метода определения активности каталазы основан на учете количества кислорода, выделяющегося при разложении перекиси водорода.
Если непосредственно измеряется объем газа, то такой метод называется газометрическим.
Ход работы: при определении активности каталазы газометрическим методом нужно использовать прибор «каталазник» (рис. 1). Он состоит из реактора – двух соединенных пробирок, – где происходит расщепление перекиси водорода за счет каталазы изучаемого субстрата. Резиновой трубкой реактор соединяется с бюреткой, с помощью которой измеряют объем кислорода. Бюретку заполняют водой, слегка подкрашенной, например, метиленовой синью, чтобы заметнее был её мениск. По вытеснению воды из бюретки можно судить о количестве освобождающегося кислорода в реакторе. Для установления мениска на определенном уровне к бюретке резиновой трубкой присоединена стеклянная груша. Бюретка и груша являются сообщающимися сосудами.
Обязательным условием работы прибора служит его герметичность.
Для проверки на герметичность присоединить к прибору реактор, закрыть зажим у бюретки и поднять вверх грушу. Если мениск в бюретке не поднимается до мениска воды в груше, то прибор герметичен и на нем можно работать.
Активность каталазы неодинакова в различных тканях, поэтому вначале надо определить оптимальный размер навески (от 0,25 г до 5,0 г и более).
|
|
Взятую навеску растительного материала поместить в фарфоровую ступку и растереть с добавлением небольшого количества битого стекла (для лучшего измельчения растительной ткани) и щепотки мела (для создания слабощелочной среды, оптимальной для работы каталазы).
Однородную кашицу количественно перенести через воронку строго в одно колено реактора. При этом затратить 20 мл воды, которую отмерить цилиндром. Воду добавлять в ступку небольшими порциями. В другое колено реактора пипеткой налить 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Заряженный реактор присоединить к прибору.
Рис. 1. Прибор для определения активности каталазы: 1 – каталазник; 2 – бюретка на 100 мл; 3 – стеклянная груша; 4 – стеклянный тройник; 5 – зажим Мора
При открытом зажиме, то есть при атмосферном давлении, поднимая или опуская грушу, установить в бюретке уровень жидкости на нулевом делении. Зажим закрыть, суспензию растительной ткани в реакторе смешать с перекисью водорода. С этого момента начать отсчет времени. Время отмерять по песочным часам. Начнется выделение кислорода, который поступит в бюретку, и жидкость в ней опустится. Для равномерного выделения кислорода смесь в реакторе постоянно переливать из одного колена в другое. Реакция должна происходить при атмосферном давлении, для создания которого жидкости в бюретке и груше поддерживать на одном уровне. Кислород будет выделяться до тех пор, пока не разложится вся перекись водорода, но обычно активность каталазы измеряется в первые 3–5 минут.
Как только закончится время наблюдения, особенно тщательно установить мениски жидкости в бюретке и груше и по бюретке определить количество выделенного кислорода. Активность каталазы выражается в миллилитрах О2, выделенного за время опыта, в расчете на 1 г сырой растительной ткани. Результаты оформить в виде таблицы 1.
Таблица 1
Схема записи опыта
Объект | Навеска, г | Время опыта, мин | О2, выделенный за время опыта, мл | Активность каталазы, мл О2, на г сырого вещества за время опыта |
Задание: в выводе указать активность каталазы исследуемого объекта и сравнить с активностью других объектов.