Методы преобразования биохимических реакций в аналитический сигнал
Амперометрический анализатор Амперометрический иммуносенсор (АИС) относится к типу электрохимических биосенсоров, измеряемым сигналом в которых является ток окисления или восстановления электроактивных частиц. В нем объединяются преимущества электродных процессов (высокая чувствительность, линейная зависимость сигнала от концентрации, селективность за счет работы при разных потенциалах) и высокая специфичность иммунной реакции. Так как напрямую определять иммунные реакции с помощью АИС не представляется возможным вследствие того, что сами по себе компоненты иммунной реакции чаще всего являются электроинертными, в систему сенсора вводятся ферментные метки. В этом случае трансдьюссер определяет концентрацию продукта ферментативной реакции фермента при расщеплении субстрата. В качестве электроактивных веществ также используются ионы металлов и другие электроактивные соединения. Наиболее распространенные ферментативные метки, использующиеся в иммуноанализе при окислении субстрата в присутствии Портативная АИС-система была разработана для определения бактерий Escherichia coli c использованием антител. Чувствительность сенсора позволяла определять наличие бактерий с концентрацией 50 клеток/мл за 22 минуты. Сенсор представлял собой мембрану, состоящую из проводящей сетки углеродных волокон, на которой иммобилизировались антитела, специфичные к антигену. При пропускании через иммунофильтрационную сетку бактерии связывались с модифицированными на ней антителами. Для выработки аналитического сигнала связавшиеся клетки маркировались специфичными антителами. Данная схема реализации иммунохимического анализа называется слоистой (sandwich-scheme). Предел обнаружения сенсора составляет 8нг/мл. Амперометрические иммуносенсоры (чаще всего используют сложные системы усиления сигнала, например с помощью ферментативной реакции, что требует дополнительных реагентов) не позволяют непосредственно контролировать протекание иммунологической реакции. Помимо этого амперометрические иммуносенсоры характеризуются более широким разбросом величины погрешности определения, в зависимости от используемой метки и схемы иммуноанализа. Наиболее часто погрешность определения составляет от 2 до 20%, хотя в отдельных случаях может быть и выше. Потенциометрический анализатор Другим классом электрохимических сенсоров являются потенциометрические сенсоры, измеряемый которыми сигнал, – это потенциал на ионноселективном электроде, изменяющийся в результате действия ионных продуктов реакции. Поверхность рабочего электрода обычно модифицируется для обеспечения селективности сенсора. Разность потенциалов между рабочим и контрольным электродом возникает в том случае, когда между ними перестают течь ионные токи. Как правило, электроды либо модифицированы образцом, либо отделены от образца мембраной и помещены в определенный электролитный раствор.
Емкостной иммуносенсор Принцип функционирования емкостного датчика заключается в измерении диэлектрических свойств органического слоя, нанесенного на один из электродов конденсатора, в результате изменения его толщины и диэлектрических характеристик. В частном случае изменение диэлектрической константы является следствием поверхностной иммунохимической реакции антиген-антитело. Структура емкостного датчика включает золотой электрод с ковалентно-привитыми к нему антителами. Сенсор позволял селективно определять молекулы анализируемого вещества при концентрациях 10-1000 нг/мл.
Кондуктометрические датчики Четвертой разновидностью электрохимических сенсоров является кондуктометрические датчики, измеряющие изменения силы тока, проходящего между двумя электродами при постоянном внешнем напряжении. Пороговая чувствительность сенсора составляет 25нг/л, а время необходимое для анализа – 15 минут.
Оптические иммуносенсоры Оптические иммуносенсоры можно разделить на три группы: прямые, не использующие метки для контроля иммунореакции, и непрямые, использующие, как правило, флуоресцентные или электролюминесцентные метки. Третья группа сенсоров осуществляет контроль концентрации окрашенного продукта ферментативных реакций. Работа хемилюминесцентные сенсоров основана на метках, генерирующих фотоны. Обычно данный вид анализатора работает по конкурентному принципу. Свет, испускаемый связавшейся меткой на границе оптоволокна, передается для усиления на фотоумножитель. К оптическим сенсорам, не использующим метки, относятся датчики поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR), функционирующие благодаря феномену вторичного возбуждения света отраженной волны свободно осциллирующими электронами (плазмонами). При определенном угле падения монохроматического поляризованного света на поверхность металлических проводников наблюдается минимум отражения, возникающего при строго определенном угле падения, названного углом резонанса. Чувствительность такого сенсора составляет порядка 0.1 нг/мл. Иммуносенсоры на основе поверхностного плазменного резонанса обычно характеризуются очень низким пределом обнаружения, а также наименьшей погрешностью определений (на уровне 2-8%) во всем диапазоне определяемых концентраций, но имеют более узкий интервал рабочих концентраций и требуют использования дорогостоящего, сложного в эксплуатации оборудования, поэтому они являются менее распространенными, по сравнению с экономичными и достаточно простыми в эксплуатации амперометрическими системами. Оптические иммуносенсоры, основанные на детектировании неферментных меток являются наиболее распространенными. Как правило, маркерами служат флуоресцентные либо люминесцентные метки, обеспечивающие высокую чувствительность анализа. Оптическое детектирование ферментных меток используется при разработке иммуносенсоров довольно редко. Необходимость длительных, многостадийных операций делает применение данных иммуносенсоров менее выгодным по сравнению с применением традиционного твердофазного иммуноферментного анализа. Наиболее успешными оказались попытки создания методик определения низкомолекулярных соединений. Таким образом, несмотря на ряд преимуществ оптических иммуносенсоров перед электрохимическими (например нечувствительность к электрическим помехам и большую безопасность при исследованиях in vivo), они остаются пока менее разработанными, чем другие виды сенсоров.
Пьезорезонансные иммуносенсоры Первыми масс-сенсорами, превзошедшими массовый предел чувствительности 1 нг, стали кварцевые пьезорезонаторы, которые сделались общедоступными 40 лет назад и с тех пор заняли лидирующие позиции во многих областях науки и промышленности. Большинство исследователей при изучении адсорбционных свойств тонких пленок используют метод кварцевого микровзвешивания, с помощью которого определяют массу монослойной пленки молекул с точностью Более современные устройства, основанные на принципе поверхностных акустических волн (surface acustic waves, SAW) пьезокристалла, практически применяются в смежных областях с методом кварцевого микровзвешивания. Их отличие от сенсоров КМВ состоит в более сложной архитектуре возбуждающих электродов, позволяющих генерировать на поверхности пезокристалла ультравысокочастотные волны. Соответственно SAW-сенсоры обладают более высокой чувствительностью в сравнении с датчиками КМВ. Описанный метод распространен благодаря надежности, разработанности и незаменимости в некоторых случаях, но имеет и недостаток, который заключается в том, что интерпретация результатов (и соответственно применение метода ) возможна для структур с известным поверхностным распределением по толщине или же для пленок с постоянной толщиной, таких, как Ленгмюра-Блоджетт. Преимуществом пьезоэлектрических иммуносенсоров является возможность прямого контроля за иммунореакцией, поскольку в случае массивных антител или антигенов отпадает необходимость использования каких-либо меток или добавления дополнительных реагентов. Пьезоэлектрические иммуносенсоры вследствие прямого контроля взаимодействия антигенов с антителами предъявляют особенно строгие требования к специфичности антител, поскольку перекрестные реакции приводят к значительным искажениям результатов. Однако при учете неспецифического связывания погрешность определений с помощью пьезоэлектрических иммуносенсоров остается относительно малой – от 3-5 до 10-15%. Существующие ограничения не снижают интереса к разработке иммуносенсорных устройств и являются скорее стимулами для более интенсивной работы в этой области. Можно отметить, выбор того или иного вида иммуносенсоров практически полностью зависит от конкретной аналитической задачи.
|
, – это щелочная фосфатаза, катализирующая реакцию дефосфорилирования различных органических фосфатов, продукт которой определяется амперометрическим методом.
г, близкой к теоретическому пределу. Кварцевое микровзвешивание (КМВ) является резонансным методом, основанном на использовании масс чувствительных пьезорезонаторов – измерительных автогенераторных устройств, задача которых состоит в преобразовании приращения присоединенной массы в приращение выходной частоты. В пьезокристалле возбуждаются продольные акустические колебания на собственной частоте. На один из электродов, напыленных на резонатор, наносят изучаемый объект, после чего записывают изменение частоты, которое можно интерпретировать как изменение массы. При внесении в систему внешней массы ее частота изменяется и разность частот до и после адсорбции служит полезным сигналом, позволяющим оценить присоединенную массу.
6015
5882