Микробиологический синтез b-каротина

Ежегодно в природе образуется около 100 млн. т каротиноидов. Значительная часть их содержится во фруктах, овощах, чем объясняется их разнообразная окраска. Известно более 400 природных каротиноидов. Биологически активны лишь 10, среди которых β-каротин, являющийся провитамином ретинола (витамина A). В организме человека β-каротин подвергается ферментативному окислительному расщеплению с образованием витамина A. На обоих концах молекулы β-каротина, включающей алифатическую цепь с 11 двойными связями, имеются кольцевые структуры β-ионона, обусловливающие провитаминную активность. Из одной молекулы β-каротина образуется две молекулы витамина A.

β-Каротин

Ретинол

Каротиноиды синтезируются растениями и микроорганизмами, но не синтезируются в организмах животных и человека. Основной функцией каротиноидов в клетках считают протекторную – защита клеток от фотодинамического действия света, ионизирующей радиации. Потребность человека в витамине А 1,5–2,0 мг/сут. При его дефиците развивается ночная слепота.

В недалеком прошлом β-каротин получали исключительно экстракцией из растительного сырья (морковь, тыква, мука люцерны). Из-за низкого выхода продукта (из 1 т моркови можно получить 60–65 г каротина) этот метод в настоящее время утратил свое значение.

В мировой практике преобладают химические методы синтеза как самого витамина А, так и β-каротина (исходное сырье – β-ионон, процесс включает 12–15 стадий), с которыми все успешнее конкурирует микробиологический синтез.

Мировое производство препаратов β-каротина оценивается в 5–10 тыс. т в год.

Области использования препаратов β-каротина:

– пищевой краситель для окрашивания кремов, сыра, маргарина, макаронных изделий и т. д.;

– кормовая добавка в животноводстве и птицеводстве;

– лечебно-профилактические средства;

– косметическая промышленность.

В разбавленных растворах β-каротин, как и другие каротиноиды, чувствителен к нагреванию, свету, кислороду, кислотам, легко подвергается изомеризации.

При микробиологическом синтезе в качестве микроорганизмов-продуцентов, способных к сверхсинтезу каротина, используют гетероталлические микроскопические грибы (Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleanus) и дрожжи (Rodotorula, Sporobolomyces, Cryptococcus). Основными промышленными продуцентами β-каротина являются различные штаммы гетероталлического гриба Blakeslea trispora. Гетероталлизм грибов выражен в образовании женского (+) и мужского (–) мицелия, при слиянии клеток которых образуются зиготы. Мицелий плюс-формы содержит больше β-каротина (окрашен в более яркую желтую окраску), чем мицелий минус-формы. Однако максимальное количество β-каротина накапливается в мицелии при совместном культивировании (+) и (–)-форм (в 5–15 раз больше, чем при раздельном культивировании форм культуры). Высокопродуктивные штаммы Blakeslea trispora способны накапливать в культуральной жидкости до 3000–4000 мг/дм³ β-каротина (для сравнения: в 1 кг моркови содержится около 60 мг β-каротина). Образование β-каротина индуцируют триспоровые кислоты (выделены из культуральной жидкости B. trispora. Эти кислоты не включаются в молекулу каротина, но стимулируют синтез изменением активности ферментных систем клеток гриба. Наиболее эффективно стимулирует синтез β-каротина β-ионон. Он также не включается в молекулу β-каротина, а служит активатором процесса биосинтеза. β-ионон токсичен для гриба, но в присутствии растительных масел (соевое, подсолнечное, кукурузное) действует как стимулятор. Выход β-каротина возростает в 1,5–2,0 раза при добавлении к питательной среде очищенного керосина. Вне клетки β-каротин малостабилен, поэтому в питательную среду вводят антиоксиданты (сантохин, аскорбиновую кислоту).

Гриб B. trispora может размножаться половым, бесполым и вегетативным путями. Половое размножение осуществляется при совместном выращивании (+) и (–)-форм, бесполое размножение – спорами, вегетативное – фрагментами мицелия. При совместном выращивании (+) и (–)-форм максимальная активность культуры зависит от их соотношения, которое определяется экспериментально для каждого штамма. В среднем соотношение (+) и (–)-форм составляет 1: 15.

Интенсивный биосинтез и накопление в клетках гриба β-каротина происходит главным образом во второй фазе развития культуры после прекращения роста мицелия.

Исходные культуры гриба представляют собой споровый или вегетативный материал раздельно хранящихся (+) и (–)-форм.

Общая схема производства препаратов β-каротина представлена на рис. 12.7.

Рис. 12.7. Технологическая схема производства β-каротина

микробиологическим синтезом

Состав питательной среды и условия культивирования для обеих форм гриба одинаковы (температура культивирования 26–30°С, рН среды 6,0–6,4, асептика, уровень аэрации 60–70 м³/(м³·ч).

Жидкая среда в качалочных колбах содержит кукурузный экстракт, кукурузный крахмал, фосфат калия, тиамин. Питательная среда для производственной ферментации включает кукурузную муку, гидрол или глюкозу, соевое масло, тиамин, сантохин (или аскорбиновую кислоту). Через 40–48 ч роста культуры в ферментационную среду добавляют β-ионон (1 г/дм³), керосин (до 5 см³/дм³).

По окончании ферментации мицелий гриба инактивируют термообработкой, отделяют фильтрованием, высушивают под вакуумом, измельчают. Кормовой препарат содержит не менее 10 г/кг каротина и представляет собой порошок от оранжево-красного до красно-коричневого цвета.

Витамин С (L-аскорбиновая кислота) производят химическим синтезом из глюкозы по методу Райхштейна. На одной из стадий технологического процесса осуществляют биотрансформацию D-сорбита, полученного восстановлением глюкозы, в L-сорбозу с помощью бактерий Acetobacter xylinum, Acetobacter suboxydans или Glugonobacter oxydans. В условиях глубинного аэробного культивирования в течение 26–28 ч на среде, содержащей 10–20% сорбита и кукурузный экстракт, бактерии трансформируют D-сорбит с выходом L-сорбозы 90–96% от теоретического.

Предшественником витамина D₂ является эргостерин (одноатомный полициклический спирт), который превращается в витамин D₂ при облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 280–300 нм. Эргостерин – основной стерин дрожжей, на который приходится 60–90% о общего количества стеринов. Дрожжи чаще всего содержат эргостерин в количестве 0,2–0,5% от сухой массы. Для промышленного производства эргостерина можно использовать дрожжи Saccharomyces cerevisiae, но наибольшее количество эргостерина (до 10% от сухой массы) накапливают дрожжи Saccharomyces carlsbergensis и Saccharomyces ellipsoideus.

Для получения кристаллического витамина D₂ дрожжевую массу гидролизуют раствором HCl при 110°С. Гидролизованную массу после охлаждения фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50% сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы B. Витамин D₂ получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, измельчают и дважды экстрагируют этиловым спиртом при 78°С при соотношении этанол: масса = 3: 1. Спиртовой экстракт упаривают до 70% СВ. Полученный липидный концентрат омыляют раствором NaOH, стерины при этом остаются в неомыленной фракции. При охлаждении раствора до 0°С выпадают кристаллы эргостерина. Производят очистку кристаллов двухкратной перекристаллизацией из спиртового раствора (70%), кристаллы сушат, растворяют в эфире, облучают УФ-светом (перевод в D₂), эфир отгоняют, витамин кристаллизуют. Препарат реализуют в виде масляного концентрата.