Реакции лизиса, как правило, проходят с участием 3-х основных компонентов: антиген, антитело, комплемент. Реакции с участием комплемента основаны на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам и лизировать при этом антиген.
Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген — антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.
Реакции бактериолиза основаны на способности комплемента лизировать бактериальную клетку после прикрепления к ее поверхности молекулы антитела. Реакцию используют как при диагностике бактериальных культур, так и определении типа сывороток. Для учета результатов применяют прямые посевы на питательные среды и через 24 часа регистрируют рост с количественным определением степени обсемененности материала.
|
|
Реакции иммоболизации по механизму сходны с реакциями бактериолиза, но учет результатов производится путем изучение подвижности объекта.
Исключением из стандартных реакций иммунного лизиса является реакция агглютинации-лизиса. В качестве антигена в этой реакции участвуют лептоспиры, которые лизируются без участия системы комплемента уже после прикрепления к их поверхности молекул антител.
Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется, при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.
|
|
Помимо вышеописанных методов современные иммунологические лаборатории для определения наличия антител или антигенов используют следующие модификации диагностических систем:
A. Иммуноферментные, методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченную ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченной ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина.
B. Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченный радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему.
C. Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра.
D. Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот); выявления на подложкеискомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции. Как диагностический метод иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса.
ЗАДАНИЕ
1. Зарегистрировать результаты постановки развернутой реакции агглютинации. Разобрать возможные варианты в диагностике заболеваний, где наиболее важно определение титра антител.
2. Произвести реакцию связывания комплемента (согласно таблице 6).
Таблица 6
ингредиенты | Пробирки | ||||
Сыворотка* | 0,25 | - | 0,25 | - | - |
Антиген | 0,25 | 0,25 | - | - | - |
Комплемент | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | - |
Физиологический раствор | - | 0,25 | 0,25 | 0,5 | 0,75 |
Гемолитическая система | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
* - сыворотка, предварительно инактивируется при 56 0С в течение 30 минут для разрушения нативного комплемента.
3. Разобрать принцип определения состояния иммунного статуса.
Контрольные вопросы
1. Т-лимфоциты, строение клетки, фазы дифференцировки, функции.
2. Цитотоксические клетки, классификация, механизмы лизиса.
3. К-клетки, механизм лизиса.
4. NK-клетки, механизм лизиса.
5. Иммунный статус, основные компоненты, диагностическое значение исследования иммунного статуса.
|
|
6. Показатели функционирования гуморального иммунитета.
7. Показатели функционирования клеточного иммунитета.
8. Показатели функционирования факторов неспецифической резистентности организма.
9. Классификация иммунодефицитов.
10. Аутоиммунные заболевания: классификация.
11. Реакции лизиса, варианты постановки, механизм.
12. Реакция связывания комплемента: механизм, значение, методика постановки.
13. Реакция иммобилизации, варианты учета результатов.
14. Реакции нейтрализации.
15. Современные модификации диагностических методов.