Плоидность

Методы изучения ДНК

Для выделения ДНК из тканей из гомогената удаляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. В процессе выделения ДНК из тканей она фрагментируется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень крупные. Такие молекулы не удобны для исследований, и их приходится еще раз фрагментировать. Для фрагментирования используют рестриктазы - ферменты, выделяемые из бактерий.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения некоторых исследований необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК и получить за 3-4 ч несколько миллионов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д.

Гибридизация. Для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот применяют метод гибридизации. Он основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80-90°С) и ренативации при последующем охлаждении. Методом гибридизации можно установить сходства и различия первичной структуры нуклеиновых кислот.

Биосинтез ДНК (репликация). Репликация - матричный процесс. Во время репликации каждая из 2 цепей ДНК служит матрицей для образования новой цепи. Молекула ДНК человека имеет очень большие размеры, репликация такой большой молекулы (скорость 50 нук-леотидов в минуту) шла бы в течение примерно 800 ч. Ввиду этого начало синтеза ДНК происходит в нескольких точках хромосомы, которые называются точками инициации репликации, или ориджи-нами (origin) репликации. По завершении репликации образуются 2 молекулы двухспиральной ДНК, каждая из которых содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную нить. В результате митоза они поступают в дочерние клетки. Таким образом, репликация обеспечивает воспроизведение генотипа в новых поколениях.

Биосинтез РНК (транскрипция). Синтез РНК на ДНК-матрице называется транскрипцией. Образованные первичные транскрипты мРНК (матричная), тРНК (транспортная) и рРНК (рибосомная) комплементарны матричной цепи ДНК.

Трансляция как механизм перевода генотипической информации в фенотипические признаки. Синтез белка отличается от других матричных синтезов тем, что между матрицей и продуктом нет комплементарного соответствия. Поскольку матрица построена из четырех нуклеотидов, а продукт - полипептидная цепь, состоящая из 20 аминокислот, существует определенный закон шифрования аминокислот в нуклеотидной последовательности матрицы, т.е. биологический код.

Биологический код - это способ записи информации об аминокислотной последовательности белков с помощью последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК. Он характеризуется следующими свойствами: триплетностью, специфичностью, наличием терминирующих кодонов, вырожденностью (см. таблицу 1).

Определяя спектрофотометрически содержание красителя в расчете на одно ядро, можно показать, что количество ДНК, приходящееся на ядро, постоянно для каждого вида. Если в процессе жизненного цикла особи наблюдается чередование гаплоидного (от англ. half - половина) и диплоидного (ди - два) числа хромосом, то это должно сопровождаться соответствующим чередованием количества ДНК на ядро. Это количество выражается буквой С. Если принять за С количество ДНК в гаплоидном сперматозоиде или яйцеклетке, то содержание ДНК в

диплоидной клетке (в зиготе или любой другой клетке, возникающей от нее путем митоза) будет равно 2С. При подготовке клетки к митозу количество ее ДНК во время S-периода увеличивается до 4С, а затем при расхождении хромосом в анафазе в каждом будущем ядре составляет 2С. Митоз способствует сохранению диплоидности клеток.

Таблица 1. Свойства биологического кода

Все образующиеся пары гомологичных хромосом сходны одна с другой, за исключением той пары, которая определяет пол. У женщины две X-хромосомы (XX), ее половые хромосомы сходны и гомологичны; у мужчин в клетках хромосомы XY, которые хотя и различаются по величине и форме, но все же достаточно гомологичны.

Диплоидный набор хромосом (2С) характерен для всех клеток тканей человека в норме. Существует метод, позволяющий окрашивать избирательно хроматин в ядре (метод Фельгена). С помощью анализа изображения или спектрофотометрии ядер, окрашенных по Фельгену, и сравнения интенсивности окрашивания их с ядрами заведомо диплоидной клетки (так, например, лимфоцита) можно определить содержание хроматина в ядрах исследуемого материала (в том числе в опухоли). Термин плоидность означает предполагаемое число хромосом в ядрах клетки на основании определения содержания хроматина в ядре, окрашенном по Фельгену. Если содержание хроматина оказывается кратным 2С, оно называется эуплоидным, если оно в несколько раз превышает 2С, оно называется полиплоидным. Синтез ДНК может протекать независимо от митоза, но тогда клетка становится полиплоидной. Полиплоидия может наблюдаться

при злокачественном росте, когда клеточная пролиферация выходит из-под генетического контроля. Возможность полиплоидии заложена в интерфазе. Полиплоидия в норме может наблюдаться при регенераторных процессах, но обычно содержание ДНК остается кратным 2С и не превышает тетраплоидного (тетра - 4). Значительная полиплоидия и гетерогенность клеточного состава по плоидности отмечается при злокачественных опухолях. Если содержание хроматина не кратно 2С, оно называется анэуплоидным (ан - отрицание). Этот показатель имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Отсутствие в опухоли анэуплоидных клеток или их небольшое число чаще говорит о ее доброкачественном характере, но может наблюдаться и при злокачественных новообразованиях. Наличие в опухолевой ткани большого числа клеток с анэуплоидным содержанием ДНК свидетельствует в пользу ее злокачественного характера; установлено также, что такие опухоли по сравнению с «эуплоидными» новообразованиями сочетаются с более неблагоприятным прогнозом. Лечение цитостатиками и облучение также приводят к образованию полиплоидных клеточных образований.