2018-03-09
1648
Механизм биосинтеза белков со всем многообразием их биологической активности и видовой специфичности был одной из крупнейших проблем в истории биохимии.
Синтез белка протекает в пять основных этапов: а) активация аминокислот; б) инициация полипептидной цепи; в) элонгация; г) терминация и высвобождение; д) сворачивание полипептидной цепи и процессинг.
Три главных открытия середины ХХ столетия, заложившие основу наших сегодняшних представлений о биосинтезе белка:
I. Местом синтеза белка из аминокислот являются рибосомы (Пол Замечник и его коллеги использовали радиоактивные метки в аминокислотах).
II. Активация аминокислот осуществляется в ходе ферментативного присоединения аминокислот к термостабильной растворимой РНК (тРНК) в цитоплазме (Пол Замечник и Мэлон Хогленд).
III. Посредником (адаптером) между генетической информацией, заключенной на мРНК и аминокислотой, присоединенной к тРНК, выступает тРНК, которая содержит участки – антикодоны, способные узнавать на мРНК триплеты, кодирующие аминокислоты (Френсис Крик).
|
|
|
На первом этапе биосинтеза белка, протекающего в цитозоле клетки, двадцать различных аминокислот присоединяются эфирной связью к соответствующим тРНК. Эти процессы катализируются двадцатью различными активирующими ферментами, называемыми аминоацил-тРНК-синтетазами, каждый из которых специфичен по отношению к какой-то одной аминокислоте и к соответствующей тРНК. Почти все аминоацил-тРНК-синтетазы E.Coli были выделены в чистом виде, и многие из них были получены в кристаллическом виде.
Общий вид катализируемой ими реакции может быть выражен уравнением
Процесс активации состоит из двух отдельных стадий, осуществляемых в активном центре фермента. На первой стадии в результате взаимодействия АТФ и аминокислоты образуется связанное с ферментом промежуточное соединение – аминоациладенилат:
Аминоациладенилат образуется в активном центре фермента:
На второй стадии аминоацильный остаток переносится с аминоациладенилата, связанного с ферментом, на соответствующую специфическую тРНК:
На этой последней стадии аминоацильный остаток связывается со свободной 2´- или 3´-гидроксильной группой концевого остатка А в молекуле тРНК.
Аминоацил-тРНК-синтетазы очень специфичны в отношении как тРНК, так и соответствующей ей аминокислоты. Если к тРНК присоединяется неправильная аминокислота и образуется ошибочная аминоацил-тРНК, то неправильный аминокислотный остаток включается в полипептидную цепь; но этого не происходит: фермент исправляет ошибки еще на первой стадии, гидролизуя аминоациладенилат:
|
|
|
По-видимому, у аминоацил-тРНК-синтетаз есть четыре специфических участка, которые участвуют в узнавании, катализе и исправлении ошибок: один для аминокислоты, второй для тРНК, третий для АТФ и четвертый для воды, необходимой для гидролиза неправильных аминоациладенилатов.
После присоединения к соответствующей тРНК аминокислота уже не участвует в определении специфичности аминоацил-тРНК, так как сама по себе аминоацильная группа не узнается ни рибосомой, ни мРНК. Специфичность аминоацил-тРНК обеспечивается исключительно структурой тРНК.
Синтез полипептидов начинается с N-конца. Инициирующей аминокислотой у прокариот служит N-формилметионин, а у эукариот – метионин. В тех преобладающих случаях, когда N-концевая аминокислота зрелого белка отличается от метионина, последний удаляется в ходе процессинга.
В стадии инициации участвует специальная метиониновая тРНК, которая называется инициаторной и обозначается тРНКiмет. Наряду с ней, у всех организмов существует другая специфичная к метионину тРНК, элонгаторная тРНКэмет. У прокариот метионин, связанный с инициаторной тРНК, формилируется по α-аминогруппе по реакции
катализируемой ферментом метионил-тРНК-формилтрансферазой, небелковой частью ее является формилтетрагидрофолевая кислота. Биосинтез белка происходит в рибосомах. В каждой клетке E.Coli имеется больше 15000 рибосом, которые составляют почти четверть сухого веса клетки.
Рибосомы прокариот состоят из двух субчастиц неравного размера – большой с коэффициентом седиментации 50S и малой с коэффициентом седиментации 30S (70S -рибосома). В состав 50S-субчастицы входит одна молекула 23S-р-РНК (~3200 нуклеотидов), одна молекула 5S-р-РНК (~120 нуклеотидов) и 34 белка. Субчастица 30S содержит одну молекулу 16S-р-РНК (1600 нуклеотидов) и 21 белок. Все белки рибосом E.Coli выделены, многие из них секвенированы. Рибосомы эукариот имеют более крупные размеры и сложнее устроены (80S рибосомы). Они так же, как и прокариотические рибосомы, состоят из двух субчастиц, размер которых варьируется у разных видов, но в среднем равен 60S и 40S. Всего эукариотические рибосомы содержат свыше 70 белков; рРНК и большинство белков эукариотических рибосом также выделены и охарактеризованы. Две субчастицы рибосомы соединены друг с другом не все время. Каждый раз, когда начинается синтез новой полипептидной цепи, рибосомы должны диссоциировать на субчастицы.
Для инициации полипептидной цепи в клетках прокариот необходимы: 1) 30S-субчастица, содержащая 16S-рРНК; 2) мРНК, кодирующая синтезируемый полипептид; 3) инициирующая N-формилметионин-тРНКf-мет; 4) три белка, называемые факторами инициации (IF-1; IF-2; IF-3); 5) GТФ.
Процесс инициации биосинтеза протекает в три стадии (рис. 11).
На первой стадии 30S-субчастица связывается с фактором IF-3, который препятствует объединению субчастиц. Затем к 30S-субчастице, связанной с фактором 3, присоединяется мРНК таким образом, что инициирующий кодон мРНК 5´AUG3´ связывается с определенным участком 30S-рибосомы. Правильное расположение инициирующего кодона AUG на 30S-субчастице обеспечивается с помощью особого инициирующего сигнала, представляющего собой участок мРНК, расположенной с 5´- стороны от кодона AUG. Этот сигнал состоит из остатков A и G и включает обычно от 6 до 8 нуклеотидов. Он узнается комплементарной последовательностью 16S-рРНК 30S-субчастицы. Это указывает на место, с которым должна связаться формилметионил-тРНКf-мет. Внутренние кодоны AUG специфичны по отношению к метионил-тРНКэмеt и не способны связывать метионил-тРНКf-меt.
На второй стадии комплекс, состоящий из 30S-IF3 и мРНК, увеличивается в результате связывания с IF-1 и IF-2, уже связанными с GTP и с инициирующей N-формилметионил-тРНКmet, которая попадает на инициирующий кодон AUG.
|
|
|
На третьей стадии инициации этот комплекс взаимодействует с 50S-субчастицей, одновременно GTP, связанная с JF-2, гидролизуется до GDР и фосфата и высвобождается из рибосомы. Факторы инициации тоже покидают рибосому. Теперь имеется функционально активная 70S рибосома, которая называется инициирующим комплексом. Она содержит м-РНК и инициирующую N-формилметионил-тРНКf-меt. В рибосоме имеется два участка связывания аминоацил-тРНК: аминоацил-, или А-участок, и пептидил-, или Р-участок. Инициирующая формилметионил-тРНК может связываться только с Р-участком. Все остальные вновь поступающие аминоацил-тРНК присоединяются к А-участку, тогда как Р-участок – это такое место рибосомы, с которого уходят «пустые» тРНК и к которому прикрепляется растущая пептидил-тРНК.
Молекулы тРНК располагаются на рибосоме таким образом, что взаимодействуют с обеими субъединицами, причем на большой субъединице в районе пептидилтрансферазного центра сближены их 3´-концевые СPCPA фрагменты, а на малой субъединице _ вблизи их антикодоновoй петли.
ЭЛОНГАЦИЯ
Присоединениекаждого аминокислотного остатка к растущей цепи происходит в три стадии. Этот цикл повторяется столько раз, сколько остатков следует присоединить. Для элонгации необходимы: а) полученный выше на стадии инициирования инициирующий комплекс; б) следующая аминоацил-тРНК, соответствующая следующему триплету РНК; в) три растворимых белка цитоплазмы, называемые факторами элонгации – EF-Tu, EF – Ts и EF-G; г) GTP.
На первой стадии цикла элонгации происходит связывание следующей аминоацил-тРНК с комплексом, состоящим из EF-Tu и GTР. Образуется тройной комплекс. Аминоацил-тРНк-Tu-GTP соединяется с инициирующим комплексом. При этом происходит гидролиз GTP, и комплекс Tu-GDP покидает рибосому, после чего с помощью GTP и фактора Ts комплексTu-GDP восстанавливается до Tu-GTP. Аминоацил-т-РНК связывается с А-участком рибосомы в результате антипараллельного комплементарного взаимодействия антикодона новой амноацил-т-РНК и соответствующего кодона матричной РНК. Точное соответствие проверяется с помощью еще одного контакта внутри А-участка между другой частью молекулы тРНК и рРНК. Следующая стадия элонгации наступает только в том случае, если оба контакта оказываются правильными (рис.12).
|
|
|
На второй стадии элонгации происходит перенос инициирующего N-формилметионинового остатка от несущей его т-РНК к аминогруппе новой аминокислоты, которая только что попала на А-участок. Этот перенос катализируется пептидилтрансферазой, особым ферментом, входящим в состав 50S-субчастицы (рис 13).
В результате такого переноса образуется пептидная связь. На Р-участке остается «пустая», ненагруженная инициирующая тРНКt-met.
На третьей стадии цикла элонгации рибосома перемещается вдоль мРНК по направлению к ее 3´-концу на расстояние в один кодон (на триплет). При этом происходит перемещение дипептида на Р-участок, в результате чего свободная тРНК отделяется от Р-участка и уходит в цитозоль, а А-участок рибосомы становится свободным и содержит третий кодон мРНК. Движение рибосомы в 3´-сторону мРНК называется транслокацией. На этой стадии необходим фактор элонгации G (транслоказа) и гидролиз еще одной молекулы GTP (рис.14).
Рибосомы являются точками приложения действия ряда антибиотиков, в том числе таких широко используемых в медицинской практике, как стрептомицин, хлорамфеникол, тетрациклин. Бактерицидное действие первых двух связано с их способностью специфично взаимодействовать только с прокариотическими рибосомами. Стрептомицин связывается с малой субъединицей, хлорамфеникол – с большой субъединицей вблизи пептидилтрасферазного центра рибосомы, подавляя тем самым биосинтез белков у бактерий и не затрагивая биосинтеза человека или животных. Тетрациклин обладает способностью взаимодействовать с малыми субъединицами в А-участках как прокариотических, так и эукариотических рибосом. Этим он препятствует отбору аминоацил-тРНК в А-участке и блокирует белковый синтез. Однако клеточные мембраны животных для тетрациклина непроницаемы, и при введении его в живой организм избирательно подавляется именно биосинтез бактерий.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Информация о последовательности аминокислот в полипептидной цепи белка записана в молекуле мРНК, а следовательно, и в соответствующем участке одной из цепей ДНК в виде последовательностей кодирующих эти аминокислоты тринуклеотидных фрагментов – кодонов. Необходимость как минимум трех нуклеотидов для кодирования каждой из 20 аминокислот вытекает из очевидных математических расчетов: число сочетаний из четырех по три. Соответствие между 64 кодонами и 20 аминокислотами, участвующими в биосинтезе полипептидов на рибосомах, получило название генетического кода. Первое доказательство самого факта существования генетического кода и первые шаги к его расшифровке были получены в эксперименте Ниренберга и Маттеи (1961 г). Они на основе экспериментальных данных сделали вывод, что триплет UUU кодирует фенилаланин, триплет ССС – пролин, триплет ААА – лизин. Полная расшифровка генетического кода стала возможной в результате успехов, достигнутых в работах Корана по синтезу олигорибонуклеотидов, что позволило получить весь набор кодонов. Было найдено, что в присутствии каждого из кодонов, за исключением кодонов UAA, UAG, UGA, с рибосомами связывается тРНК, несущая определенную аминокислоту. Этим все кодоны были приведены в соответствие с одной из 20 аминокислот. Полная структура генетического кода приведена в таблице.
Коды считываются в направлении 5´-3´. Третье основание в кодоне менее специфично, чем первые два. Всем аминокислотам, кроме метионина и триптофана, соответствует больше одного кодона (код вырожденный). Как видно из таблицы, распределение аминокислот по кодонам весьма неравномерно. «Слова» аминокислотного кода в том виде, в каком они записаны в ДНК, комплементарны кодовым словам мРНК, но антипараллельны им и содержат остатки Т в положениях, комплементарных А, и остатки А в положениях, комплементарных U.
| Первая буква кодонов (5´-конец) | U | Вторая буква кодонов U C A G | |||
| UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu | UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser | UAU Tyr UAC Tyr UAA Стоп UAG Cтоп | UGU Cys UGC Cys UGA Стоп UGG Trp | ||
| С | CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu | CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro | CAU His CAC His CAA His CAG His | CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg | |
| A | AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met | ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr | AAU Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys | AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg | |
| G | GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val | GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala | GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu | GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly | |
Например:
5´ – CTTACGTACCATAAACGCAACC – 3´ ДНК
3´ – GAAUGCAUGGUAUUUGCGUUGG – 5´ РНК
м-РНК 5´ – GGUUGCGUUUAUGGUACGUAAG -3´.
