Трансформация - то перенос вектора в клетки специального штамма E. coli Трансформация состоит из двух частей это получение компетентных клеток с ночного высева бактерий с суспензионную среду и непосредственно трансформация. Между этими двумя этапами часто используют недлительную заморозку в жидком азоте или холодильнике на -80, что улучшает производительность.
Получение компетентных клеток проходит в несколько этапов:
-Отдельную бактериальную колонию засеять в 5 мл среды LB (10 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl довести 5 М NaOH до pH = 7,4, автоклавировать при 1,2 атм (127°С в течение 1 ч) 14– 16 ч в термостатированной качалке 180 об./мин при температуре 37°С.
-Утром 500 мкл этой культуры засеять в 50 мл LB и подрастить до определенной опт.плот.
-Перенести в центрифужные пробирки, охладить во льду в течение 30 мин. Центрифугировать клетки при 4°С 3 000 об./мин в течение 5 мин.
-Супернатант тщательно удалить, а осадок аккуратно ресуспендировать в 15 мл буфера RF-1. Инкубировать во льду 15 мин и центрифугировать клетки при 4°С и 3 000 об./мин в течение 5 мин. Супернатант тщательно удалить. Осадок очень мягко ресуспендировать в 3 мл буфера RF-2 и инкубировать во льду 15 мин.
|
|
-Клетки расфасовать в охлажденные эпиндорфы по 100 мкл и сразу поместить в низкотемпературный холодильник на –70°С.
Непосредственно трансформация осуществляется действием на клетки теплового шока, после добавления раствора плазмиды, смесь охлаждают до +4 градусов, а затем на 2 минуты помещают на водяную баню на +42 градуса.
Ход:
В реакцию трансформации взять 100 мкл компетентных клеток, которые предварительно оттаить во льду. К клеткам добавить 10 мкл охлажденной лигазной смеси (у нас готовая плазмидка), осторожно перемешать и поставить в лед на 30 мин.
Затем клетки подвергнуть тепловому шоку при температуре 42оС в течение 2 мин и охладить во льду в течение 10 мин. В это время клетка «захватывает» плазмиды
Клетки засеять на чашки Петри с агаризованной средой LB с необходимым количеством селективных маркеров (антибиотик был) и инкубировать в термостате при 37°С в течение 16 ч.
Объясните, как проводится отбор трансформированных клеток E.coli; какими методами проводится подтверждение наличия вставки гена интереса в отобранных предположительно трансформированных колониях.
Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).
|
|
Отбор клонов осуществляется реакцией ПЦР на исследуемые вставки. Детекция амплифицированного ПЦР-продукта осуществляется так же с помощью электрофореза
Изложите принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР); укажите состав компонентов реакционной смеси «Мастер микс» для ПЦР, температурный режим реакции ПЦР, проведенной на лабораторных занятиях.
Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).
Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям.
Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают праймеры (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами
Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:
-Выделенную ДНК из исследуемого образца,
-Буферный раствор,
-Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),
-Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.
-Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.
-Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus).
Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов:
Денатурация (94оС, 3 минуты) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.
Отжиг праймеров (55оС,30 сек.) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.
Элонгация (72оС, 2-3 мин.) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.
У нас был еще Последний цикл - 22оС, 2 мин – синтез второй цепи ДНК
Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР
ПЦР Мастер Микс включает:
- Taq ДНК-полимеразу (0,05 U / мкл),
- реакционный буфер,
- 4 мМ MgCl2 и
- 0,4 мМ каждого dNTP(дезоксинуклеотид-5-трифостфаты)
-20 х 1,25 мл воды, свободной от нуклеазы (эт на 1000 реакций)
Для постановки реакции ПЦР в мастер-микс требуется добавить только олигонуклеотиды, образец ДНК и воду.