Проводят их с целью выделения вирусов, подробного изучения их свойств и выяснения роли в этиологии болезни.
В настоящее время выделение вирусных агентов производят на однослойных клеточных культурах, которые выращивают в сосудах (пробирках, матрацах) in vitro. Однослойные клеточные культуры, которые являются своеобразной питательной средой для вирусов, могут быть первичными и перевиваемыми.
Первичные клеточные культуры. Первичные однослойные клеточные культуры получают путем расщепления ферментом (трипсином, панкреатином, версеном) ткани рыб. Для этого чаще всего используют недозрелые гонады, почки, плавательный пузырь и кожу живых рыб. После расщепления клетки собирают и разводят в специальных питательных средах, которые вырабатываются медицинской и ветеринарной промышленностью (основная среда Игла, минимальная среда Игла, среда 199, гидролизат лактальбумина). К данной среде добавляют 5—10 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Полученную клеточную взвесь разливают в пробирки или флаконы и выращивают в термостате при температуре 22— 26 °С. На 2—5-й день клетки разрастаются и образуют сплошной слой (монослой), который и используют для выделения вирусов.
Перевиваемые клеточные культуры. Перевиваемые линии клеток отличаются от первичных тем, что они имеют неограниченную энергию роста и пересеваются из сосуда в сосуд, то есть производится субкультивирование.
В нашей стране выращивают в основном две перевиваемые клеточные линии — ЕРС (полученную из эпителия оспенных разростков карпа) и FHM (полученную из кожно-мышечной ткани пимефала).
Для поддержания непрерывного роста клеточных линий после образования монослоя проводят регулярное субкультивирование, для чего:
старую питательную среду из пробирок удаляют, клеточный слой заливают раствором смеси трипсина и версена (раствор трипсина-версена вносят в сосуд из расчета полного покрытия клеточного слоя) и оставляют на 2—4 мин для воздействия его на клетки. После помутнения клеточного
206
слоя раствор ферментов удаляют, а в сосуд вносят небольшое количество питательной среды и встряхивают до полного отделения клеток от стекла; в качестве питательной среды используют минимальную среду Игла (MEM) или при отсутствии ее — основную среду Игла (среда 199 или гидролизат лак-тальбумина) с добавлением 5—10 % сыворотки крови телят и смеси антибиотиков: пенициллина — 100 ЕД, стрептомицина 200 мкг, а при угрозе заноса плесени — нистатина — 5—50 мкг на 1 мл; для получения однородной клеточной суспензии проводят пипетирование в течение 1—2 мин, после чего добавляют питательную среду, в 4 раза больше первоначально использованной для культивирования. Суспензию клеток разливают в пробирки по 1 мл или в матрацы (в зависимости от емкости) и выращивают в термостате при температуре 24— 26 °С. Клеточный слой (монослой) развивается на 2—3-й сутки и может быть использован для заражения исследуемым материалом.
Порядок исследования. Во флакон с 10 мл солевого раствора Хеикса, содержащего 500 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в 1 мл, вносят стерильной пастеровской пипеткой 1 мл 10 %-ной суспензии, приготовленной из тщательно растертого исследуемого материала на буферном или физиологическом растворе поваренной соли. Выдерживают 60—90 мин при комнатной температуре, затем отсасывают мнкропипеткой надосадочную жидкость и вносят по 0,2 мл в клеточные культуры. Для исследования одной пробы отбирают 8—10 пробирок с хорошо развитым монослоем, половину из которых используют для заражения, а остальные — для контроля.
Зараженные клеточные культуры выдерживают при комнатной температуре в течение 40—60 мин (для адсорбции вирусного агента на клетках), после чего доливают в пробирки по 0,8 мл питательной среды, содержащей 1 % сыворотки крови телят (поддерживающая среда), и инкубируют в термостате при температуре 22—26 °С.
Ежедневно просматривают зараженные культуры под микроскопом и учитывают результаты. При появлении дегенерации клеточного слоя в результате цитопатического действия (ЦПД) вируса проводят последовательные пассажи. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое действие вирусного агента.
В дальнейшем подробно изучают свойства выделенного вируса: патогенность для рыб (биопроба), морфологию при помощи электронной микроскопии, устойчивость к физическим II химическим факторам воздействия, а также аппн'енные СВОЙСТВ ai
207
Бактериологические исследования
Их производят для выяснения роли выделенных бактерий в этиологии болезни и определения чувствительности к антибиотикам.
Для исследования берут только живую рыбу. При взятии материала соблюдают правила асептики.
Прежде чем приступить к работе, необходимо приготовить стерильные инструменты, посуду и питательные среды. В качестве питательных сред при бактериологических исследованиях в ихтиопатологии чаще всего используют мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясо-пептонный желатин (МПБ, МПА, МПЖ), приготовленные по прописям, общепринятым в бактериологии. Первичные посевы для накопления бактерий производят обычно на МПБ, МПА, МПЖ.
Прежде всего исследуют материал с пораженных участков кожи, мышц, жабр (слизь, язвы, абсцессы, фурункулы и др.). Язвы перед отбором материала промывают стерильным физиологическим раствором, содержимое абсцессов и фурункулов набирают пастеровской пипеткой, соблюдая правила асептики. Кровь для посевов берут из сердца или хвостовой вены.
По окончании посевов из поверхностного материала вскрывают рыбу и производят посевы из внутренних органов.
Рыбу вскрывают на пробковых или деревянных досках, обработанных спиртом или 3—5 %-ным раствором карболовой кислоты. Обычно рыбу кладут на правый бок. Мелких рыб фиксируют препаровальными иглами, а крупных экземпляров обездвиживают, разрушая спинной мозг. Туловище рыбы с левой стороны освобождают от слизи и чешуи и протирают спиртом. Вскрытие начинают с брюшной стенки выше ануса и дугообразно делают ножницами разрез вперед и вверх к позвоночному столбу и далее к жаберной крышке. Вырезанный лоскут брюшной стенки удаляют, открывая доступ к внутренним органам.
После вскрытия брюшной полости производят первичные посевы из внутриполостной жидкости, печени, почек, селезенки и других органов. Посевы из кишечника (если есть необходимость) делают в последнюю очередь.
Посевы выдерживают в термостате при температуре 24— 26 °С в течение 24—48 и более часов, в зависимости от интенсивности роста бактерий и предполагаемого возбудителя.
Одновременно или после окончания посевов готовят мазки из поверхностных пораженных участков, крови сердца, жидко-| in брюшной полости, внутренних органов и содержимого кишечника.
Вы ".кипе чистых культур бактерий, изучение их морфо-
логических, культуралыю-биологических и других свойств проводят по общепринятым в бактериологии методам.
В последние годы в медицинской и ветеринарной практике перед назначением лечения определяют чувствительность выделенных бактерий к антибиотикам. Главное управление ветеринарии МСХ СССР 15 января 1975 г. одобрило «Временные рекомендации по определению чувствительности к левомицети-ну и хлортетрациклину бактерий, выделенных от больных краснухой рыб». Рекомендованный метод основан на избирательном отношении к указанным антибиотикам двух родов условно-патогенных бактерий, выделяемых при краснухе карпов — Aeromonas и Pscudomonas.
Заключается он в следующем: от 5 рыб отбирают пробу из внутренних органов, жидкости брюшной полости и высевают в МПБ. На следующий день смесь из выросших бульонных культур высевают на чашки с МПА и растирают для образования равномерного газона и накладывают диски с левомице-тином и хлортетрациклином. Выращивают при температуре 26 °С. Результат учитывают через 24 ч.
Зона задержки роста бактерий вокруг диска до 15 мм свидетельствует о нечувствительности их к данному антибиотику, от 15 до 20 — о чувствительности, а свыше 20 — о высокой чувствительности бактерий к антибиотику.