Изучение местного действия вещества на слизистую оболочку глаза

Изучаемый продукт закапывают в конъюнктивальный мешок глаза кролика (не менее 3 животных) в количестве 1 капли. Твердые вещества вносят в количестве 50 мг (дисперсность частиц до 10 мг). После внесения вещества на 1 мин прижимают слезноносовой канал у внутреннего угла глаза. Внесение вещества производят однократно.

 

Проводят наблюдения за прозрачностью роговицы и состоянием слизистой оболочки глаза ежедневно в течение 2 недель. Регистрируют появление и выраженность гиперемии и отека слизистой оболочки глаз, инъекцию сосудов склеры и роговицы.

 

Оценку повреждающего действия химических соединений на слизистую оболочку глаза кролика по степени гиперемии и отека, а также количеству выделений возможно проводить по балльной системе, предложенной A.Majda и K.Chuscielska (Medicine Pracy, XXIV, 1973, 3, 321-336; приложение 2).

 

Развитие изъязвлений слизистой оболочки глаз, помутнения роговицы, рубцовых изменений век свидетельствует о наличии у вещества резко выраженного раздражающего эффекта.

 

 3. Исследование раздражающих свойств вещества при ингаляции

О выраженности раздражающих свойств вещества при ингаляции судят по величине для экспериментальных животных (белых крыс) и человека. Классификация раздражающих веществ по величине приведена в приложении (приложение 3).

 

3.1. Определение порога раздражающего действия вещества при ингаляции для белых крыс.

 

При установлении промышленных веществ в эксперименте на животных необходимо проводить комплексное исследование функционального состояния дыхательной системы и использовать показатели, отражающие состояние ее различных отделов. Наиболее ранними проявлениями раздражающего действия промышленных ядов при ингаляции являются изменения частоты дыхания и чувствительности обонятельного анализатора, усиление миграции клеточных элементов на поверхность слизистой оболочки верхних дыхательных путей и легких, развитие паранекротических изменений в ткани легких, угнетение активности сурфактанта легких.

 

Экспозиция - однократно, 4 часа.

 

Вид животных - белые крысы, масса тела 180-240 г. Минимальная статистическая группа - 10 особей.

 

Обследование животных проводится непосредственно после окончания затравки.

 

Определение целесообразно начинать с концентраций вещества на уровне . В дальнейшем (в зависимости от полученного результата) изучаемые концентрации вещества понижают или повышают в 2-3 раза. Во всех случаях необходимо установление концентрации изучаемого вещества, не оказывающей раздражающего эффекта на дыхательную систему экспериментальных животных. За принимается минимальная концентрация изучаемого химического соединения, вызывающая статистически значимые изменения функции дыхательной системы (по перечисленным выше показателям) по сравнению с контролем.

 

3.1.1. Измерение частоты дыхания.

 

Для регистрации частоты дыхания у крыс целесообразно использовать способ, рекомендованный Р.М.Любимовой-Герасимовой (Гигиена труда и профзаболевания, 1968, N 4, 54-60). Принцип указанного способа состоит в регистрации ЭДС, возникающей в термобатарее, укрепленной у морды животного, при изменении температуры вдыхаемого и выдыхаемого воздуха.

 

Для регистрации частоты дыхания животных во время экспозиции можно использовать комплекс приборов, состоящий из датчиков (термобатарей), усилителя, интегратора и системы коммутации. Животных (белых крыс) помешают в домик с вмонтированным в него датчиком. Величина импульса увеличивается при помощи усилителя (в качестве усилителя может быть использован электрокардиограф, электроэнцефалограф и т.д.), после чего он подается на интегратор. В качестве интегратора можно использовать пульсотахометр (например, ПТ-2). В том случае, если интегратор имеет лишь один канал, чередование регистрации частоты дыхания следует производить с помощью включенного в схему переключателя на 12-20 каналов (по числу подопытных и контрольных животных). Изучение частоты дыхания производится при чередовании подопытных и контрольных животных. Определение существенности отличий частоты дыхания подопытных и контрольных животных осуществляется с помощью метода условных средних, за которые принимали средние траектории частоты дыхания на всем протяжении экспозиции.

 

3.1.2. Регистрация паранекротических изменений в легких.

 

О развитии паранекротических изменений в легких судят по способности ткани фиксировать краситель.

 

Исследование проводят по методу Я.Н.Ажина (1962) в модификации А.Л.Германовой.

 

Животным (крысам) сразу после затравки в боковую вену хвоста вводят нейтральный красный краситель в количестве 0,2 мл на 100 г массы тела.

 

Раствор 1% нейтрального красного красителя приготавливается на физиологическом растворе; перед употреблением краска подогревается до 100 °С в течение 30 мин. Для того, чтобы вена была хорошо видна, рекомендуется подогрев хвоста крысы в теплой воде (45-50 °С). Время введения краски отмечается по секундомеру. Животных забивают пересечением позвоночника со спины (чтобы не перерезать трахею и исключить тем самым попадание крови в легкие) через 1 и 10 мин после инъекции.

 

После забоя трупы животных вскрывают и извлекают легкие; 500 мг ткани легкого погружают в герметично закрытый, заранее заготовленный бюкс, содержащий 5 мл 1% солянокислого спирта. Кусочек легкого измельчают в бюксе кончиками острых ножниц (бюксы должны иметь одинаковый диаметр дна). Через 24 часа раствор сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют для осаждения мелких кусочков свернувшейся крови и устранения мутности.

 

Определение количества красителя производят на ФЭКе при зеленом светофильтре (546-550 нм) в кювете, толщиной 5 мм; отсчет по левому барабану.

 

Определяют экстинкции экстрактов, полученных из легкого крыс, забитых через 1 и 10 мин после инъекции красителя. Показатель экстинкции экстракта из легких крыс, забитых через 1 мин после инъекции красителя, оценивают как "накопление" красителя нейтрального красного в легких.

 

Вычисление показателя "выведения" производится путем нахождения разности между экстинкцией экстрактов, полученных от крыс, забитых через 1 и 10 минут после введения красителя. Полученную разность делят на 9 (разность во времени между двумя сериями опытов).

 

3.1.3. Определение "остроты обоняния".

 

В основу объективной ольфактометрии у животных положен ольфакто-респираторный рефлекс, который заключается в изменении дыхательного ритма вследствие обонятельного ощущения.

 

Определение чувствительности обоняния ("остроты обоняния") животных проводят к 4 веществам, используемым в клинической практике - дегтю, тимолу, камфоре и розмарину. Дозированную подачу запаховых компонентов осуществляют по способу Elsberg и Levy в модификации М.Г.Медведовского.

 

Животных помещают в домики с термобатареей. Через отверстие в носовой части домика пахучие вещества подают в зону дыхания животного. О реакции животного судят по изменению частоты дыхания, которую регистрируют в течение 20 сек до подачи вещества, во время и в течение 20 сек после прекращения подачи ольфактивного компонента.

 

Изменение частоты дыхания на 5 и более в минуту считают признаком реакции животного.

 

Интервал между испытанием последовательных доз запаховых компонентов составляет 2 минуты; между испытанием различных ольфактивных веществ - 10 минут.

 

Как установлено при обследовании 670 здоровых белых крыс обоего пола, изменение частоты дыхания вызывают следующие минимальные количества воздуха, содержащего перечисленные запаховые компоненты: для дегтя - 0,4±0,01 мл, для камфоры - 0,45±0,01 мл, для тимола - 0,46±0,01 мл, для розмарина - 0,4±0,01 мл.

 

3.1.4. Изучение клеточной реакции легких и верхних дыхательных путей.

 

Известно, что количественный и качественный состав свободных клеток на поверхности слизистых оболочек дыхательных путей характеризует выраженность ее патологических изменений.

 

Исследование клеточной реакции легких и верхних дыхательных путей следует проводить по методу La Bell и Brieger в модификации Г.С.Комовникова.

 

Крыс забивают через 1 час после окончания экспозиции изучаемого вещества путем внутрибрюшинного введения 1,0 0,1% раствора нембутала. Вскрывают грудную клетку животных, перевязывают трахею, лигатуры подводят под пищевод и завязывают. Легкие вместе с трахеей извлекают за лигатуры из грудной полости. Промывают легкие от крови в физиологическом растворе. Трахею надрезают, вставляют канюлю, перевязывают и помещают в специальный вращающийся штатив, так, чтобы легкие оказались внизу, а канюля сверху. К канюле присоединяют шприц с 10 мл физиологического раствора и вводят раствор в легкие. Затем штатив переворачивается и промывная жидкость поступает обратно в шприц. Количество полученного перфузата фиксируют и добавляют краситель Романовского-Гимза. Несколько капель перфузата помещают в камеру Розенталя и подсчитывают общее количество клеток, число макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов и эпителиальных клеток. Полученные величины пересчитывают на объем полученного перфузата.

 

Для изучения клеточной реакции верхних дыхательных путей у тех же животных через трахею выше места перевязки вводится зонд в носоглотку и производится смыв 10 мл физиологического раствора. Далее исследование промывной жидкости производят так же, как смывов из легких.

 

Регистрируют количество нейтрофилов, лимфоцитов и эпителиальных клеток.

 

3.1.5. Измерение активности сурфактанта легких.

 

Поверхностно активные свойства сурфактанта легких изучают с помощью прибора Ленгмюра-Вельгельми или других, которые позволяют проводить регистрацию поверхностного натяжения испытуемой жидкости.

 

Оценку функциональных свойств легочного сурфактанта проводят по формуле Clements I.A., Hustead R.F., Johnson R.P. и др.:

 

,

где - показатель стабильности, характеризующий состояние энергетического баланса поверхности, на которой располагается смыв из легких;

 

- максимальное поверхностное натяжение;

 

- минимальное поверхностное натяжение.

 

3.2. Определение для человека.

 

Для исследования привлекаются практически здоровые люди в соответствии с положениями инструкции "О привлечении добровольцев для токсикологических исследований" (Приложение 4).

 

Экспозиция изучаемого вещества - 1 мин.

 

О действии вещества судят по субъективным ощущениям раздражения. Регистрируют количество испытуемых, ощущающих раздражение при вдыхании вещества в определенной концентрации. Полученные результаты обрабатывают статистически с вычислением среднеэффективной концентрации, которую принимают за .

 

Целесообразно использовать для определения объективные показатели (частота мигания, скорость самоочищения легких и др.).

 

 4. Обоснование ПДК избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны

Для обоснования ПДК и других профилактических мероприятий для избирательно действующих раздражающих веществ в эксперименте на животных необходимы следующие сведения:

 

- условия производства и применения вещества, количество рабочих, контактирующих с веществом;

 

- характеристика местного раздражающего и кожно-резорбтивного действия вещества;

 

- токсичность и характер действия вещества при однократном воздействии на организм;

 

- порог вредного действия при однократном поступлении вещества в организм по интегральным показателям;

 

- порог раздражающего действия вещества при однократном ингаляционном воздействии.

 

4.1. Условия производства и применения вещества.

 

Представляются сведения о способе производства и областях применения; дается характеристика производственной среды (в том числе концентрации вещества в воздухе). Описываются условия поступления вещества в воздух и его агрегатное состояние в воздухе. Указывается количество работающих, имеющих контакт с веществом.

 

4.2. Данные о химическом строении и физико-химических свойствах вещества.

 

Необходимо иметь структурную формулу вещества, данные о молекулярной массе, плотности, точке кипения (плавления), упругости паров при 20 °С, стойкости (гидролиз, окисление и т.д.) и возможных продуктах превращения в воздухе. Следует указать растворимость в воде, жирах и других средах. Желательно привести коэффициент растворимости паров в воде, показатель преломления, поверхностное натяжение, энергию разрыва связи и др.

 

4.3. Характеристика действия вещества на кожу и кожно-резорбтивного действия.

 

Исследование влияния вещества на кожу выполняется в соответствии с п.1 настоящих Методических указаний. Изучение кожно-резорбтивного действия вещества проводится в соответствии с Методическими указаниями "Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование ПДУ загрязнений кожи" N 2102-79.

 

4.4. Определение средне-смертельной концентрации вещества при ингаляции.

 

Опыты проводятся на белых мышах или белых крысах. Экспозиция - однократно, 2 часа для белых мышей и 4 часа для белых крыс. Минимальная статистическая группа - 10 животных. Регистрация гибели животных проводится в течение 14 дней после экспозиции.

 

4.5. Определение для белых крыс.

 

Экспозиция - однократно, 4 часа. Минимальная статистическая группа - 10 животных. Обследование проводится непосредственно после окончания экспозиции. Показатели: интегральные тесты (мышечная сила, работоспособность, поведенческие реакции и др.).

 

При наличии сведений о возможном влиянии вещества на какой-либо орган или систему организма следует использовать адекватные показатели, отражающие их функциональное состояние.

 

4.6. Определение вещества для белых крыс и человека в соответствии с п.3 настоящих Методических указаний.

 

4.7. В случае проводится вычисление ПДК вещества в воздухе рабочей зоны по следующей формуле:

 

(мг/м ),

где - порог раздражающего действия вещества для белых крыс;

 

- порог раздражающего действия вещества для человека;

 

- зона раздражающего действия;

 

- концентрация вещества, вызывающая гибель 50% подопытных животных при ингаляционном воздействии.

 

При отсутствии данных о вычисление величины ПДК следует проводить по формуле:

 

(мг/м ).

 

Приложение N 1

 МОДЕЛЬ "ПОТОВОЙ" ЖИДКОСТИ

1. Натрий хлористый	2 г
2. Калий хлористый	300 мг
3. Кальций хлористый	40 мг
4. Молочная кислота	1 г
5. Мочевина	400 мг
6. Аммоний сернокислый	350 мг
7. Нашатырный спирт	1 мл
8. Аспарагиновая кислота	200 мг
9. Фенол чистый	80 мг
10. Ацетон	30 мг

 

Перечисленные компоненты растворяются в 1 л дистиллированной воды и Рн доводится до 4,5.

 

Приложение N 2

 ОЦЕНКА ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ ГЛАЗА КРОЛИКА ПО A.Majda и K.Chrusaielska

А. Гиперемия конъюнктивы и роговицы оценивается по следующим признакам:

 

1. Сосуды инъецированы - 1 балл.

 

2. Отдельные сосуды трудно различимы - 2 балла.

 

3. Диффузное глубокое покраснение - 3 балла.

 

Б. Отек век:

 

1. Слабый отек - 1 балл.

 

2. Выраженный отек с частичным выворачиванием век - 2 балла.

 

3. В результате отека глаз закрыт наполовину - 3 балла.

 

4. В результате отека глаз закрыт больше, чем наполовину - 4 балла.

 

В. Выделение:

 

1. Минимальное количество в углу глаза - 1 балл.

 

2. Количество выделений увлажняет веки - 2 балла.

 

3. Количество выделений увлажняет веки и окружающую кожу - 3 балла.

 

При резко выраженных повреждениях глаза суммарное количество баллов равно 10.

 

Приложение N 3

 КЛАССИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ РАЗДРАЖАЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ, ПО ВЕЛИЧИНЕ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

 

1. Чрезвычайно раздражающие	<20	<500	<50	<900
2. Высоко раздражающие	20-200	500-5000	50-500	900-9000
3. Умеренно раздражающие	201-2000	5001-50000	501-5000	9001-90000
4. Мало раздражающие	>2000	>50000	>5000	>90000

 

________________

* Оценивается по комплексу показателей, изложенных в настоящих Методических указаниях.

 

Приложение N 4

 О ПРИВЛЕЧЕНИИ ДОБРОВОЛЬЦЕВ ДЛЯ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

(Общее положение и требования)

1. Участие людей-добровольцев в токсикологических исследованиях допускается при гарантии безопасности их состояния здоровья на современном уровне знаний.

 

2. Экспериментам с участием человека обязательно должны предшествовать опыты на животных с установлением недействующей и минимально эффективной концентрации (дозы) изучаемого вещества. Учитывая возможность видовой и индивидуальной вариабельности в чувствительности животных и человека, эксперименты с участием людей следует начинать с изучения концентраций (доз) вещества ниже пороговых, установленных в опытах на животных. Для раздражающих веществ следует начинать исследования с концентрации в 3 раза ниже порога раздражающего действия для лабораторных животных.

 

3. Обязательным является добровольное согласие (в письменной форме) испытуемого на участие в исследовании. Санкцию на проведение исследования с участием людей дает администрация учреждения, в котором оно выполняется.

 

4. К токсикологическим исследованиям допускаются лица не моложе 18 лет и не старше 50 лет, прошедшие медицинский контроль и признанные практически здоровыми.

 

5. К токсикологическим исследованиям не допускаются беременные и кормящие женщины, а также люди, находящиеся в какой-либо зависимости от исследователя (в том числе административно подчиненные).

 

6. Люди, участвующие в токсикологическом эксперименте, должны быть осведомлены о сущности исследования. Проведение исследования проходит под наблюдением врача.

 

7. При проведении токсикологического исследования с целью разработки санитарных нормативов количество испытуемых на одну концентрацию (дозу) должно быть не менее 10. В состав испытуемых должны входить лица обоего пола.

 

 

Электронный текст документа

подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:

/ Министерство здравоохранения СССР. - М., 1980

Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны (Источник: ИСС "ТЕХЭКСПЕРТ")